Мембранные потенциалы, Synaptic Ответы, нейронной цепи, Нейромодуляция и мышцы гистологии Использование раков: Упражнения Студенческая лаборатория

Общие цели следующих экспериментов заключаются в том, чтобы понять свойства возбудимых мембран и ионную основу мембранного потенциала покоя, а также изучить методы измерения мембранного потенциала, а также продемонстрировать свойства синаптической передачи. В одной из частей эксперимента будет измерен потенциал мембраны покоя при изменении внеклеточного калия. В другой части эксперимента будут исследованы механизмы синаптической дифференцировки путем записи стимулированных синаптических реакций в различных моторных единицах.

Далее представлена нейронная цепь, которую легко обслуживать. Этот препарат может быть использован как для обучения, так и для исследования различных аспектов сенсорной цепи от ЦНС до моторных нейронов и мышц. Эта серия экспериментов демонстрирует простоту использования модели раков для решения проблем, связанных с мембранной потенциальной синаптической интеграцией и передачей, а также структурными различиями типов мышечных волокон.

Основными преимуществами использования препарата из раков в обучении электрофизиологическим концепциям и методам являются легкость вскрытия, жизнеспособность препарата с минимальным содержанием физиологического раствора, легкость получения синаптических реакций и легкость различения общего анатомического расположения мышц. Эти методы также могут быть применены к другим препаратам и углубят наше понимание синаптической физиологии и модуляции, а также биохимических и структурных различий в демонстрируемом препарате. Чтобы начать операцию, выберите рака длиной примерно от шести до 10 сантиметров и поместите его в колотый лед на пять минут, чтобы обезболить его, обезглавите рака, держите его с затылка, следя за тем, чтобы ваши пальцы были вне досягаемости когтей и рта рака, используя большие ножницы.

Быстро удалите голову, сделав чистый надрез из-за глаз рака, удалите ноги и клешни рака, чтобы избежать травм. Снимите укладки с мужчин и плавательные костюмы как с мужчин, так и с женщин. Утилизируйте голову и придатки.

Далее отделите брюшную полость от грудной клетки, сделав надрез вдоль сочленяющейся мембраны, которая соединяет брюшную полость и грудную клетку. Сохраните брюшную часть раков и утилизируйте грудную клетку, направив ножницы немного вниз в сторону брюшной стороны, и под углом сделайте надрез в панцире по нижней боковой границе каждой стороны брюшка. Будьте осторожны, чтобы не врезаться в раков слишком глубоко.

Следуйте естественному рисунку панциря из линий раков, которые проходят по длине каждого сегмента с помощью щипцов. Удалите подфюзеляжную часть скорлупы, потянув ее вверх и назад. Заботясь о том, чтобы не разрушить мышцы живота.

Удалите мышцы-сгибатели. В этот момент можно увидеть белую массу ткани на вершине глубоких мышц-сгибателей. Удалите эту ткань осторожно с помощью щипцов.

Желудочно-кишечный тракт теперь виден в виде небольшой трубки, проходящей вдоль средней линии глубоких мышц-сгибателей. Снимите его, зажав щипцами в верхней части и оттянув от живота. Разрежьте нижнюю часть желудочно-кишечного тракта на конце хвоста.

Промойте вскрытие солевым раствором, чтобы каловые отходы не мешали приготовлению. С помощью рассекающих штифтов прикрепите верхний и нижний углы препарата к чашке Петри, покрытой S-образным защитным покрытием. Мышцы-разгибатели брюшной полости теперь обнажены.

Налейте в чашку Петри солевой раствор, чтобы покрыть препарат до тех пор, пока не будут выполнены внутриклеточные записи. Переместите чашку Петри в микроскоп и используйте воск под чашкой, чтобы предотвратить ее перемещение. Аппаратура, используемая для внутриклеточной регистрации, показана на этом рисунке.

Соответствующие подключения и настройки приведены в сопроводительном тексте. Настройте программное обеспечение для создания лабораторных карт в соответствии с инструкциями. В сопроводительном тексте поместите провод заземления в ванну с солевым раствором.

Поместите кончик стеклянной микропипетки, наполненной тремя молярами хлорида калия, в солевую ванну и проверьте сопротивление электродов. Сопротивление электродов должно составлять от 20 до 60 мегаом. С помощью грубой ручки на усилителе переместите линию на лабораторной диаграмме к нулю при освещении высокой интенсивности.

Посмотрите в микроскоп и определите продольные мышцы ЦМР. С помощью электродного зонда введите внутриклеточный электрод в мышечное волокно ЦМР-мышцы. Электрод едва следует вводить в мышечное волокно.

Будьте осторожны, чтобы не проникнуть полностью через клетку. Измерьте амплитуду потенциала покоя. Перетащите курсор M на трассу из положения в левом нижнем углу окна графика.

Поместите маркер M на базовую линию и переместите курсор в самую нижнюю точку на записанном сигнале. Разница между маркером и активным курсором отображается в правой верхней части экрана. Эта величина представляет собой напряжение потенциала мембраны покоя.

Разделите записанное напряжение на величину усиления, в этом случае использовалось 10-кратное усиление. Затем преобразуйте напряжение из вольт в милливольты. После регистрации потенциала покоя для этого мышечного волокна посмотрите в микроскоп и осторожно извлеките электрод из мышечного волокна.

Повторите внутриклеточную запись на других мышечных волокнах. В следующей части этого эксперимента будет отслеживаться влияние повышения концентрации внеклеточного калия на мембрану покоя. Потенциальные шесть солевых растворов раков будут использоваться с концентрациями калия 5,4, 20, 40, 60, 80 и 100 миллимоляров.

Выберите мышцу, которая не дергается, для следующей внутриклеточной записи между записями. Замените раствор для ванны следующей более высокой концентрацией раствора хлорида калия. Обязательно покрывая подготовку полностью каждый раз.

Запишите изменения мембранного потенциала для каждого решения. Эффект повышения внеклеточной концентрации калия, мембранного потенциала показан на этом графике снимка мембранных потенциалов покоя для каждой концентрации калия на полулогарифмическом графике зависимости внеклеточного калия от мембранного потенциала. Выровняйте потенциал покоя на уровне 5,4 миллимолярных внеклеточных калиев.

Для гипотетических и наблюдаемых кривых сравните наклон наблюдаемой линии с наклоном гипотетической линии. После завершения этих электрофизиологических записей следующим шагом является изучение анатомии мышечных волокон и характера их иннервации. Переложите заготовку на стоячую посуду и добавьте метиленовый синий.

Через пять минут удалите метиленовый синий и добавьте свежий солевой раствор для раков. Ищите главный нерв, который иннервирует мышцы в сегменте. Нарисуйте схему иннервации мышц S-E-M-D-E-L 2D EL one и DEM в сегменте.

Далее переместите препарат под вытяжной шкаф. Удалите физиологический раствор и добавьте фиксатор. Фиксатором, используемым здесь, является раствор пуана.

Назначение вытяжного шкафа – избежать попадания паров фиксатора. Будьте очень осторожны, чтобы этот раствор не попал на кожу или в глаза. Если глаза начинают гореть, немедленно промойте их на станции для промывания глаз.

Дайте раствору бойна постоять на препарате около 10 минут, а затем с помощью пипетки замените раствор на физраствор. Вырежьте тонкий отрезок DEL одной или DEL двух мышц. Поместите его на предметное стекло.

Подпишите слайд. Повторите процедуру для СЭМ-мышцы. С помощью составного микроскопа можно просмотреть рисунок полосчатости саркомера в обоих тканевых препаратах.

В следующей серии экспериментов будет рассмотрено, как регистрировать синаптические реакции в мышцах живота рака. Выберите другого рака, обезглавьте его. Удалите грудную клетку и придатки и обнажите мышцы-разгибатели живота, как показано во время операции.

В первом разделе этого видео с помощью микроскопа найдите нерв, несущий моторные аксоны к мышцам-разгибателям. Ищите сегмент с наиболее доступным нервом. Нерв белого цвета, и его можно увидеть, используя пипетку для распыления физиологического раствора на препарат или слегка подув на препарат.

Это заставляет нерв двигаться и, таким образом, облегчает его идентификацию. Поместите всасывающий электрод, удерживаемый микрометровым манипулятором, непосредственно над нервом. Аккуратно потяните за шприц, чтобы втянуть нерв в электрод.

Через микроскоп можно увидеть, как нерв всасывается в электрод. Отрегулируйте параметры в программном обеспечении для создания лабораторных карт, как указано в сопроводительной статье. Заполните трехмолярный стеклянный микроэлектрод из хлорида калия и подключите его к головному столику и силовой лаборатории.

С помощью ручки курса на усилителе переместите линию на лабораторной диаграмме в ноль. Перед вставлением электрода ручку тумблера следует включить и выключить несколько раз. Для того чтобы проверить сопротивление электрода, измерьте амплитуду полученных значений.

Посмотрите в микроскоп и с помощью электродного зонда введите электрод в одно из продольных мышечных волокон, либо ЦМР, либо DL один, либо DL два. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть через мышечное волокно. Теперь подготовка к эксперименту готова.

Всасывающий электрод используется для стимуляции сегментарного нервного пучка, а стеклянный микроэлектрод используется для записи синаптического ответа от мышечного волокна. Затем поместите электрод в мышечное волокно SEL. SEL — это тонизирующая мышца.

Стимулируйте нерв короткими импульсами с частотой 10 герц для тонических реакций. Сравните записанные реакции мышц DEL и SEL. Обратите внимание, что фазовые мышцы DEL имеют большую амплитуду синаптических реакций, чем тонические мышцы SEL.

Следующая серия экспериментов сосредоточена на мышцах-сгибателях рака, а не на мышцах-разгибателях. Начиная с нового рака, изолируйте брюшную полость, как показано на этой операции. В первой части этого видео поместите изолированный хвостовой препарат в чашку Петри, наполненную солевым раствором, приколите хвост и верхнюю часть препарата.

Обратите внимание, что дек Каро проводит эксперименты на тонизирующих мышцах-сгибателях, вентральный нервный канатик должен быть оставлен нетронутым. С помощью скальпеля начните продольный разрез через сочленяющуюся мембрану между двумя ребрами на брюшной стороне препарата. Будьте очень осторожны и не режьте слишком глубоко при выполнении этого разреза, так как глубокий порез может пересечь корешок двигательного нерва, чтобы не повредить поверхностные мышцы.

Сделайте следующий шаг. Глядя в микроскоп с помощью ножниц или скальпеля, надрежьте горизонтально от продольного разреза тонкий мембранный слой, покрывающий мышцу. Увеличьте срез, чтобы получился лоскут из шарнирной мембраны, и поднимите лоскут вверх.

С помощью ножниц отрежьте лоскут, обнажив поверхностные мышцы-сгибатели для внутриклеточной записи от поверхностных мышц-сгибателей. Используйте те же приборы и установку, которые использовались для регистрации мембранного потенциала покоя и синаптических реакций разгибателей брюшной полости. Как и раньше, используйте внутриклеточный электрод, наполненный тремя молярами хлорида калия.

Вставьте электрод в мышечное волокно поверхностных мышц-сгибателей, стараясь не проникнуть через мышцу. Запишите спонтанную активность EPSP. Обратите внимание на различные размеры EPSP и наличие IPSP.

Возьмите маленькую кисть и осторожно проведите кистью по краю кутикулы в том же сегменте, где находится записывающий электрод. Обратите внимание на любые изменения частоты или размера EPSP из-за стимуляции, если наблюдается более сильная реакция. Это указывает на привлечение дополнительных моторных нейронов, реагирующих на изменение в возбуждении сенсорных нервов.

Осторожно замените солевой раствор для ванны на раствор, содержащий нейромодулятор, такой как один микромолярный серотонин или физиологический раствор, пузырчатый углекислым газом. Затем повторите стимуляцию кистью. Обратите внимание на влияние, которое изменение раствора для ванны оказывает на регистрируемую активность.

Замените солевой раствор для ванны обратно на нормальный солевой раствор и наблюдайте, как активность мышечных волокон возвращается к исходному уровню. На этом рисунке показаны EPSP, зарегистрированные в поверхностном мышечном волокне сгибателя. Обратите внимание на различные размеры EPSP.

На следующем этапе этого эксперимента используется внеклеточный электрод для мониторинга потенциалов действия моторных нейронов, реагирующих на активность в цепи сенсорной цепи ЦНС и моторных нейронов. Начните с изготовления отсасывающего электрода для стимуляции сенсорных нервов. Натяните кусок пластиковой трубки на пламя.

Следующим шагом является обрезка трубки до нужного размера. Для этого вам нужно будет посмотреть на нерв при подготовке, чтобы определить желаемый диаметр отверстия для вашего аспирационного электрода. В зависимости от размера рака, нервные пучки могут варьироваться по размеру от примерно одного миллиметра до нескольких миллиметров в диаметре.

Отрежьте натянутый участок трубки, чтобы отверстие в наконечнике имело правильный размер для удержания нерва. Если отверстие слишком большое, нерв может выпасть. Если отверстие слишком маленькое, нерв может быть поврежден давлением электрода.

Поместите пластиковую трубку на кончик стеклянного электрода. Электрофизиология и настройка программного обеспечения немного отличаются от мониторинга внеклеточных реакций по сравнению с внутриклеточными записями. Оборудование, как указано в сопроводительной статье, отсасывает третьим путем, который иннервирует поверхностную мышцу-сгибатель в отсасывающий электрод.

Теперь вы можете начать записывать потенциалы действия. Этот путь имеет пять возбуждающих моторных нейронов и один ингибиторный моторный нейрон. После записи исходной активности стимулируйте кутикулу щеткой, чтобы наблюдать за изменением генерируемых потенциалов действия.

После этого замените раствор для ванны нейромодуляторами, такими как серотонин, как и в предыдущем эксперименте, и запишите любые изменения в реакции. Дополнительные упражнения приведены в сопроводительном тексте. Эта запись показывает потенциалы действия, зарегистрированные от третьего пути до и во время стимуляции кутикулы щеткой, сравнивают частоту потенциалов действия до чистки зубов с их частотой во время стимуляции.

Эта запись показывает потенциалы действия, зарегистрированные при третьем пути в обычном физиологическом растворе и в растворе серотонина. Сравните частоту потенциалов действия в обычном физрастворе с их частотой и серотонином, как показано только что. Чистка щеткой увеличивает частоту срабатывания по сравнению с базовым уровнем.

Также было продемонстрировано, что серотонин увеличивает частоту возбуждения по сравнению с обычным физиологическим раствором. На этом рисунке видно, что при совмещении чистки зубов и серотонина происходит еще большее увеличение частоты срабатывания. Сравнение внешних и теоретически полученных эффектов влияния внешней концентрации калия на мембранный потенциал покоя указывает на влияние ионов на мембранный потенциал.

Мы также показали вам, как регистрировать нейронные реакции в нервно-мышечных соединениях как фазических, так и тонических мышц. Эти методы могут быть использованы в исследовательских студенческих лабораториях для преподавания фундаментальных концепций и физиологии. Методы, полученные в ходе этого лабораторного упражнения, могут быть использованы для ответа на вопросы, связанные с другими лабораторными препаратами, а также с физиологическими приложениями, связанными с медициной и здоровьем.