Полимеразной цепной реакции: основные протокол Plus Устранение неполадок и оптимизация стратегии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать этапы полимеразной цепной реакции или ПЦР, которая используется для получения достаточного количества определенного сегмента ДНК из небольшого количества исходного материала. Сначала соберите реагенты и материалы, которые будут использоваться в реакции ПЦР, затем настройте реакционную смесь, включая четыре дезоксирибонуклеотида, матрицу ДНК, праймеры и ДНК-полимеразу. Далее программируем термические циклические условия и запускаем реакцию ПЦР.

После этого. Проверьте результаты, чтобы определить, была ли реакция успешной. В конечном счете, полимеразная цепная реакция должна дать определенный ампликон желаемого размера продукта.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим протоколом, испытывают некоторые трудности с настройкой расчетов каждого из переменных реагентов, и иногда у них возникают проблемы с пипетированием, правильными объемами, особенно с полимеразой, которая содержит глицерин. Начните эксперимент со свеженаполненного ведерка со льдом. Надевайте перчатки, чтобы не загрязнить реакцию.

Смесь и реактивы. Разложите компоненты ПЦР на льду до полного оттаивания. К ним относятся праймеры ДНК-матрицы, ДНК-полимераза 10 x реакционный буфер с хлоридом магния или без него, дезоксинуклеотиды, стерильная вода и хлорид магния.

Хлорид магния необходим при использовании буфера без хлорида магния. Поместите 96-луночный планшет в ведро со льдом в качестве держателя для тонкостенных ПЦР-пробирок объемом 0,2 миллилитра. Теперь оборудуйте верстак ПЦР-пробирками и колпачками.

Штатив для пробирок ПЦР, устойчивый к этанолу маркер и набор микропипеток. Всегда составляйте таблицу реагентов с подробным описанием реакционной смеси с квантовой стерильной дистиллированной водой для получения конечного объема 50 микролитров. Например, использование пяти микролитров буфера без магния, одного микролитра 10 миллимолярных DN NTP и оптимизированного 4,0 миллимолярного магния.

Один микролитр из каждых 20 микромолярных грунтовок, 0,5 микролитра двух нанограмм на микролитровый шаблон. А на 0,5 микролитра полимеразы потребуется всего 33 микролитра стерильной воды. Добавьте хлорид магния, если его нет в 10-кратном буфере или если это необходимо для оптимизации ПЦР.

Промаркируйте пробирки для ПЦР маркером, устойчивым к этанолу, на каждой реакционной пробирке. Сначала добавьте рассчитанное количество стерильной воды, затем добавьте 10 х буфер и 10 миллимолярных DN NTP. Для этой реакции мы проводим титрование хлоридом магния.

Так как концентрация магния не будет постоянной, хлорид магния добавляют в ПЦР-пробирки по отдельности, а стерильной водой нормализуют объем до 10 микролитров, таким образом, чтобы в каждую ПЦР-пробирку добавляется 40 микролитров окончательной мастер-смеси. Чтобы завершить реакцию на 50 микролитров и хлорида магния, продолжайте добавлять матрицу ДНК и праймеры. Наконец, добавьте от 0,5 до 2,5 единиц ДНК-полимеразы на 50 микролитров реакции в 1,8-миллилитровую микропробирку.

Подготовьте основной раствор для смешивания, достаточный для контроля и потерь при переносе пипетки. Установите микродозатор примерно на половину общего объема раствора и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Для каждого испытуемого образца красноречиво смешайте мастер в ПЦР-пробирку.

Теперь для отрицательного контроля без матрицы ДНК добавьте все реагенты и используйте стерильную воду для компенсации недостающего объема ДНК. Затем для положительного контроля используют набор матричной ДНК и праймеров, которые амплифицируют известный фрагмент в тех же условиях, что и экспериментальные образцы ПЦР. Термоамплификаторы для ПЦР быстро нагревают и охлаждают реакционную смесь, что позволяет проводить термоиндуцированную денатурацию дуплекса, коленчатую деформацию ДНК праймеров к плюсовой и минусовой нитям матрицы ДНК и удлинение продукта ПЦР.

Время цикла основано на размере матрицы и содержании GC в ДНК для общей формулы. Начните с первоначальной денатурации шаблона, затем начните от 25 до 35 раундов трехступенчатой программы температурного цикла. Первым этапом этих циклов является денатурация матрицы ДНК.

Затем запрограммируйте оптимальное, вдавливание праймеров примерно на пять градусов Цельсия ниже кажущейся температуры плавления праймеров, с последующим этапом удлинения для доведения полимеразы до матрицы ДНК и синтеза продукта ПЦР. Теперь введите количество циклов. Следующая программа.

Увеличенный шаг удлинения для завершения синтеза ампликонов. Наконец, включите завершающий этап, охладив смесь до четырех градусов Цельсия. Если стандартные условия ПЦР не дают желаемого ампликона, для достижения лучших результатов необходима оптимизация ПЦР.

Поэтому, если реакции не сработали с первого раза, вы хотите попытаться устранить неполадки с реакцией. Итак, во-первых, вы хотите убедиться, что проблема не была человеческой ошибкой. И это может произойти, если у вас ошибка в пипетировании или если вы забыли добавить реагент в тест, одну из пробирок.

Затем вы можете попробовать изменить некоторые строгости условия, чтобы вы могли изменить настройку термоамплификатора, или вы можете изменить концентрацию магния в качестве другого альтернативного метода. Также можно попробовать добавить в реагент некоторые добавки для устранения неполадок. В качестве альтернативы можно рассматривать ПЦР с горячим стартом как универсальную модификацию, при которой начальное время денатурации резко увеличивается.

Затем гель-электрофорез AROS используется для разрешения ПЦР трех гена GAL из геномной ДНК S. seia для определения оптимальной концентрации ионов магния для этого набора реагентов, обратите внимание, продукт ПЦР ожидаемого размера. 2098 пар оснований появляются, начиная с концентрации магния 2,5 миллимоляра с оптимальной концентрацией в четыре миллимольяра на разных матричках ДНК амплификация желаемого продукта ПЦР в качестве дискретной полосы требует двух миллимолярный магний. Снижение жесткости реакции до фактически неоптимальных условий амплификации приводит к образованию мазка неспецифических продуктов.

Кроме того, при общей строгости восстановления реакции требуется меньшее количество иона магния для формирования значка ампликона. Таким образом, оптимизация ПЦР с учетом переменных может привести к получению дискретного желаемого продукта. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить и приготовить полимеразную цепную реакцию.

Цель состоит в том, чтобы понять переменные каждой ПЦР и то, как ими можно манипулировать для создания желаемого ампликона.