Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Общая цель этой процедуры заключается в определении последовательностей транскриптов мРНК от трех простых концов до областей в пределах кодирующей белок области с использованием специфичных для транскриптов вложенных праймеров в двух последующих ПЦР и секвенирования очищенных продуктов ПЦР. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики, такие как определение сигнала полиаденилирования, стоп-кодона и последовательности нетранслируемой области транскрипта с тремя простыми числами. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может быть применен к любому транскрипту, если последовательность небольшой области открытой рамки считывания является Применение этого метода распространяется на диагностику рака, поскольку он может обнаруживать опухолевые специфические гены слияния и варианты сплайсинга.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы идентифицировали новые транскрипции с ранее не охарактеризованными нетранслируемыми областями с тремя праймами. Чтобы начать протокол, разморозьте клеточную смесь фенола и гуанидина изотиоцианата на льду. После размораживания добавьте 100 микролитров хлороформа в микроцентрифужную пробирку в ПЦР-шкафу.

Нанесите образец на вихрь в течение 10–15 секунд, пока смесь не станет розовой и непрозрачной. Далее инкубируйте образец на льду в течение 15 минут. После инкубации образец центрифугируют в течение 15 минут при температуре 20, 800 г и четырех градусах Цельсия.

Осторожно удалите верхнюю бесцветную водную фазу и переложите ее в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем переходите к осаждению и добавляйте в образец равный объем изопропанола. Добавьте в образец один микролитр со-преципитанта, чтобы он действовал как носитель для РНК и помогал визуализировать РНК на последующих этапах.

Инкубируйте образцы при температуре 80 градусов Цельсия в течение не менее четырех часов. После инкубации поместите образец в охлаждаемую центрифугу и вращайте в течение 35 минут при температуре 20, 800 г и четырех градусах Цельсия. После вращения РНК будет отображаться в виде синего пятна на дне пробирки.

Осторожно удалите изопропанол из пробы. Добавьте 500 микролитров 80% этанола и повторно суспендируйте гранулу путем кратковременного вортекса в течение трех секунд. Снова центрифугируйте образец.

Удалите весь этанол из образца и дайте образцу высохнуть на воздухе в течение примерно 10 минут. Как только образец высохнет, повторно суспендируйте его в 35 микролитрах воды, не содержащей РНКазы. Затем поместите образец на нагревательный блок.

Установите при температуре 65 градусов Цельсия на пять минут, чтобы убедиться, что РНК полностью находится в растворе. После нагревания сразу же поставьте трубку на лед. Для конечного объема реакции 50 микролитров добавьте четыре микрограмма общей РНК с добавлением воды до общего объема 22 микролитра в новую пробирку.

Добавьте два микролитра грунтовки Oligo dT 25 из 10 микромолярного раствора грунтовки. Из набора для обратной транскрипции добавьте два микролитра ингибитора РНКазы, восемь микролитров 5-кратного реакционного буфера, четыре микролитра 10 миллимолярных dNTP и два микролитра обратной транскриптазы. Настройте реакцию без обратной транскриптазы, чтобы она действовала как отрицательный контроль.

Инкубируйте пробирку при температуре 42 градуса Цельсия в течение одного часа. После инкубации перенесите трубку непосредственно в лед перед транспортировкой в нагревательный блок. Затем нагрейте трубку до 75 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Нагрев его до 75 градусов по Цельсию, поместите трубку на лед. Перенесите два микролитра кДНК в свежую 0,5-миллилитровую ПЦР-пробирку. Добавьте один микролитр прямого праймера и один микролитр обратного праймера из 10-миллимолярного раствора праймера.

Сделайте до 12,5 микролитров, добавив 8,5 микролитров воды без нуклеаз, и добавьте 12,5 микролитров смеси 2x PCR to gel master. Затем введите условия термоциклирования ПЦР, перечисленные на экране, и запустите ПЦР. После ПЦР приготовьте 1%-ный агарозный гель, окрашенный бромидом этидия.

Растворите один грамм агарозы в 100 миллилитрах триацетата или буфере TAE в колбе объемом 250 миллилитров. Отварите содержимое в микроволновой печи. Дайте гелю остыть в течение одной минуты, и добавьте 7,5 микролитров раствора бромида этидия в вытяжной шкаф.

Хорошо перемешайте, поворачивая колбу. Вылейте содержимое в горизонтальный гелевый аппарат и дайте гелю застыть при комнатной температуре в вытяжном шкафу не менее 30 минут. Накройте гель 1x TAE буфером и загрузите 10 микролитров продукта ПЦР на агарозный гель вместе с тремя-пятью микролитрами лестницы молекулярной массы ДНК.

Запустите гель при напряжении 175 вольт в течение 10 минут. Для первой ПЦР перенесите один микролитр кДНК в ПЦР-пробирку и добавьте пять микролитров 10-кратного реакционного буфера Pfu. Добавьте один микролитр первого вложенного прямого праймера, один микролитр праймера T7 Oligo dT 25 и один микролитр dNTP из 10 миллимолярного раствора.

Сделайте до 49 микролитров от общего объема, добавив 40 микролитров воды. Добавьте один микролитр ДНК-полимеразы Pfu и хорошо перемешайте. Затем запустите ПЦР.

Далее готовят второй ПЦР. Переложите два микролитра продукта из первой ПЦР в новую ПЦР-пробирку и смешайте ее с пятью микролитрами 10x Pfu ultra two reaction buffer. Добавьте один микролитр второго вложенного праймера для ПЦР, один микролитр праймера Т7 и один микролитр dNTP.

Сделайте до 49 микролитров общего объема реакции, добавив 39 микролитров воды и добавив один микролитр ДНК-полимеразы Pfu. Запустите ПЦР, используя тот же профиль ПЦР, что и при первой настройке ПЦР. В качестве альтернативы, вместо использования ДНК-полимеразы Pfu, в двух разных ПЦР можно использовать химерную ДНК-полимеразу.

Возьмите пять-десять микролитров второго продукта для ПЦР и запустите его на агарозном геле. Наконец, визуализируйте результат на тепловизоре. Этот агарозный гель представляет собой два различных продукта для ПЦР, в которых используется один и тот же прямой праймер, но разные обратные праймеры, и отдельный продукт для ПЦР, который имеет разные прямые и обратные праймеры.

Идеальными праймерами для использования в реакции на основе ПЦР являются те, которые дают один отдельный продукт ПЦР. Продукты второй реакции ПЦР с ДНК-полимеразой Pfu и химерной ДНК-полимеразой давали продукты ПЦР одинакового размера, несмотря на различные условия циклирования ПЦР для трехпростого RACE. Отрицательный контроль с обратной транскриптазой не показал геномной контаминации РНК, используемой в синтезе кДНК, а также в последующих реакциях.

Очищенные гелем ПЦР-продукты были отправлены на секвенирование. Репрезентативная последовательность Сэнгера из хроматограммы последовательности идентифицировала местоположение стоп-кодона, предполагаемого сигнала полиаденилирования и сайта, а также поли-А хвоста в трехпростом продукте RACE. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать постоянно носить защитное снаряжение и перчатки.

Кроме того, используйте стерильную ДНКазу и РНКазу для реагентов, пробирок и других одноразовых материалов. Не забывайте, что работа с фенолом и хлороформом может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование реагентов в вытяжке и утилизация материала в специально отведенном контейнере для отходов.