Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции

Применение ячеек, инкапсулированных в небольшие капли размером пиколитера, часто было ограничено невозможностью контролировать количество клеток в капле. Этот протокол демонстрирует метод управления инкапсуляцией клеток путем объединения двух различных микрофлюидных явлений: динамического упорядочивания клеток жидкости и генерации капель на микросопле, фокусирующем поток. В канале выше по течению обеспечивается достаточно высокая скорость потока водного раствора со взвешенными элементами или частицами, что вызывает образование поездов с равным расстоянием в направлении потока вниз по течению.

Сопло для генерации капель, фокусирующее поток, используется для формирования водных капель со скоростью килогерц в стабилизированной поверхностно-активным веществом допустимой жидкости-носителе масла. Упорядоченные последовательности частиц ячеек затем объединяют с генерацией капель путем настройки скорости потока воды и масла для обеспечения скорости генерации капель, которая синхронизирована с приходом продольно упорядоченных ячеек или частиц в сопло генерации капель, в то время как частицы используются в качестве суррогатов ячеек. Чтобы продемонстрировать этот протокол, скорость потока должна быть достаточно мала, чтобы ограничить жидкость.

Это явная нагрузка на биологические клетки, перекрытие клеточного порядка, образования капель и жизнеспособности клеток. Ограничения расхода воды обеспечивают идеальный рабочий режим для контролируемой инкапсуляции одиночных и нескольких ячеек. Анализ данных видеомикроскопии показывает, что эффективность инкапсуляции как одиночных, так и двойных ячеек или частиц превосходит эффективность случайной инкапсуляции и значительно снижает количество капель, которые не содержат желаемого количества клеток или частиц.

Удержание клеток и капель ограничивает разбавление клеточного секрета, подчеркивает гетерогенность клеток, а также контролирует межклеточные сигналы по сравнению с объемной суспензией. Эффективные средства для инкапсуляции этих клеток в капли являются ценным инструментом для биологических исследователей, чтобы начать эту процедуру. Спроектируйте массив микроканалов, как показано на этом рисунке, в программе AutoCAD.

Длинная секция канала представляет собой канал упорядочивания водного потока шириной 27 микрон. На схеме увеличенного сопла показана равная ширина канала 27 микрон для канала водного упорядочивания и масляного канала, за которым следует сужение сопла на 22 микрона и внезапное расширение до более широкого канала размером 61 микрон. Высота устройства составляет 52 мкм.

Как водные, так и масляные входные отверстия имеют большие фильтры для мусора с зазорами в порядке ширины упорядоченного канала, как показано на этой увеличенной схеме масляного входа. Показывать. Вот реальное изображение канала заказа и сопла, в которое впрыскивается краситель. Наймите стороннего производителя для печати прозрачной маски с высоким разрешением на майларовой пленке или кварце, где каналы прозрачны на темном фоне.

Впоследствии создать мастер-мастер из кремния и SU eight фоторезиста для литья реплик. Прикрепите мастер-форму к дну чашки Петри для формования реплики PDMS. После того, как формовка реплики завершена и контур устройства вырезан, используйте биопсийный перфоратор диаметром 0,75 мм, чтобы пробить жидкостные порты в трех круглых областях, показанных на этом рисунке, дорогой скотч на стороне шаблона PDMS и отклеить, чтобы удалить любую пыль после плазменного соединения.

PDMS на чистое стекло микроскопа подставляют. Поместите все устройство в духовку и постепенно прогревайте духовку до 120 градусов Цельсия. Оставьте устройство в духовке при температуре 120 градусов Цельсия на ночь, чтобы завершить склеивание и вернуть PDMS в исходное гидрофобное состояние.

Альтернативным методом придания стеклянной поверхности канала гидрофобности является впрыскивание покрытия, такого как aquae, в отверстия для жидкости и последующая продувка воздухом. С помощью одномиллилитрового шприца и иглы шприца втяните несколько сотен микролитров воздуха, а затем небольшое количество орла, достаточное для заполнения только металлическим наконечником шприца, осторожно, но твердо введите воду, а затем продуйте воздух в жидкостные порты. Без агрессивного склеивания PDMS со стеклом.

Повторите продувку воздухом всех впускных и смотровых отверстий, удаляя излишки воды, чтобы избежать отложений, которые могут засорить каналы после сушки. Контроль концентрации клеток имеет важное значение для достижения нужного количества клеток к нужному количеству капель. Это включает в себя две сложные составляющие.

Для конкретного устройства, используемого в этом исследовании, клетки или частицы размером от 8 до 15 микрон должны быть адекватно упорядочены для контролируемой инкапсуляции. В этой демонстрации 9,9 микронные микросферы polys diary будут использоваться в качестве заменителей клеток для приготовления концентрации водной суспензии частиц для достижения идеальной аудиторской инкапсуляции, начиная с концентрации микросфер в 1% твердых веществ по весу, используя предыдущие данные для полного упорядочения. В качестве ориентира увеличьте концентрацию до 1,5% твердых веществ, мягко центрируя один миллилитр исходного образца, удаляя 250 микролитров супинатной жидкости, и суспендируя частицы путем вихревого или более мягкого смешивания.

При использовании ячеек и ячейки, и частицы полистирола имеют удельный вес больше единицы, хотя и не показаны в этом видео. Для длительных экспериментов, длящихся от нескольких минут до нескольких часов, раствор может иметь плавучесть, соответствующую добавлению растворенного вещества, такого как хлорид кальция для частиц или opti prep для клеток. После того, как клетка или суспензия частиц будет готова, приготовьте 10-миллилитровый образец непрерывной фазы фторуглеродного масла в вихре центрифужной пробирки объемом 15 миллилитров.

Смешайте поверхностно-активное вещество и фторуглеродное масло примерно до 2,5% веса по весу. Здесь мы получаем весовую смесь 2,4 веса, что приемлемо для постановки эксперимента по микроинкапсуляции. Сначала включите питание для инвертированного оптического микроскопа и высокоскоростной камеры.

Сосредоточьтесь на микроканальном слое и осмотрите каналы на предмет засоров и мусора, который может сместиться. Выберите канал без крупного мусора или явных засоров. Отрежьте три длины полупрозрачной трубки из ПВХ Tigon для водного входного отверстия масла и выхода эмульсии, чтобы свести к минимуму мертвый объем.

Отрежьте трубку ровно настолько, чтобы она дотянулась от шприцевых насосов до микроскопа. Столик Отрежьте концы трубок под углом 45 градусов Чтобы облегчить введение в жидкостные порты, используйте пинцет, чтобы вдавить концы трубки в жидкостные порты. Затем вставьте иглу шприца из нержавеющей стали с тупым наконечником 30 калибра в свободный конец водной входной трубки.

Повторите то же самое для впускной трубки для масла. Переместите устройство и прикрепите трубку к предметному столику микроскопа с помощью объектива в 20 раз, выровняйте и сфокусируйтесь на сопле устройства. Вручную отрегулируйте микроскоп для освещения по шкале Колера, чтобы обеспечить оптимальное освещение в фокальной плоскости.

С помощью программного обеспечения высокоскоростной камеры можно обрезать поле зрения вокруг сопла, чтобы обеспечить более высокую частоту кадров, а затем установить частоту кадров, время экспозиции и другие настройки камеры по мере необходимости для оптимальной записи. Далее наполните одномиллилитровый шприц заранее приготовленным хорошо перемешанным раствором водной фазы. Наполните трехмиллилитровый шприц раствором масляной фазы.

Наклоните один из наполненных шприцев вертикально и проведите по нему, чтобы переместить пузырьки воздуха к выходному отверстию шприца. Медленно нажмите на поршень достаточно долго, чтобы протолкнуть воздух к кончику шприца, удерживающему шприц вертикально. Подсоедините шприц к соответствующей игле шприца, уже прикрепленной к устройству.

Нажмите на поршень, чтобы протолкнуть воздух через иглу шприца, мертвый объем до тех пор, пока жидкость не протолкнется по трубке почти к устройству, надежно закрепите шприц на шприцевом насосе и зацепите блок плунжера. Повторите соединения для второго шприца и установите его на второй шприц, насос питания на каждом шприцевом насосе и запрограммируйте каждый насос. Используя протоколы производителя, установите начальную скорость потока 50 микролитров в минуту для масляной фазы и пять микролитров в минуту.

Для запуска водной фазы насосы ждут, пока каждая жидкость поступит в устройство, и заполняют каналы, выталкивая оставшийся мертвый воздух. Это может занять несколько минут при использовании начальной скорости потока. Наблюдайте за образованием капель у насадки.

Медленно увеличивайте скорость потока в воде, чтобы наблюдать за упорядочиванием частиц в длинном канале водного раствора. Поскольку скорость потока увеличивается, она не увеличивается до такой степени, что струя водного потока жидкости инициируется в сопле, как показано в этом примере, используя другое примечание к соплу генерации капли, здесь возникает неравномерный поток и неравномерное падение. Если концентрация частиц слишком мала для обеспечения чередующихся последовательностей с относительно небольшим числом отсутствующих частиц и выталкивающая сила образца не совпадает, физически наклоните шприцевой насос в сторону выходного отверстия шприца, чтобы обеспечить постепенное осаждение частиц к выходным отверстиям шприца.

После того, как произойдет соответствующая систематизация, отрегулируйте расход масла, чтобы настроить частоту генерации и размер капель. Итеративная регулировка скорости потока для достижения желаемой скорости инкапсуляции и объема капель. После подтверждения стабильной заказанной инкапсуляции переместите выпускную трубку из резервуара для отходов в резервуар для сбора для использования в будущем.

Инкапсуляция одинарных и двойных частиц или ячеек может быть достигнута с высокой эффективностью. Использование этого протокола, показанного здесь, является репрезентативным результатом инкапсуляции одиночных частиц со скоростью потока масла 60 микролитров в минуту и скоростью потока в воде девяти микролитров в минуту. Лямбда, среднее количество частиц для капли составляет 0,95.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет от 17 до 18 микрон для полностью упорядоченных переменных частиц. Скорость образования капель в этом примере составляет 6,1 килогерц при среднем размере капель 24,4 пиколитра. Гистограмма сравнивает эффективность капельной инкапсуляции частиц порядка инкапсуляции одиночных частиц с плюсом.

По статистике, при случайной инкапсуляции для выборки размером 517 капель средняя доля капель, содержащих одну частицу, составляет 79,5%, в отличие от прогнозируемой фракции случайной инкапсуляции, равной 36,7%. Доля частиц, которые попадают в правильно инкапсулированные капли, составила 83,7% при размере выборки в 491 частицу. в то время как фракция случайной инкапсуляции составляла 37,3%Двойная инкапсуляция достигается простым снижением скорости потока масла до 30 микролитров в минуту при сохранении скорости потока воды на уровне девяти микролитров в минуту. Здесь лямбда, среднее количество частиц в одной капле составляет 1,8. Аналогично инкапсуляции одиночных частиц.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет от 17 до 18 микрон для полностью упорядоченных переменных частиц. Более крупные капли имеют средний размер капель 39,8 пиколитров и формируются со скоростью 3,8 килогерц по сравнению со случайной инкапсуляцией. Для образца размером 383 капли средняя доля упорядоченных инкапсуляционных капель, содержащих две частицы, составляет 71,5% по сравнению с прогнозируемой фракцией случайной инкапсуляции, равной 26,8%Доля частиц, которые имеют тенденцию накапливаться в правильно инкапсулированных каплях, составила 79,5% для образца размером 689 частиц, в то время как фракция случайной инкапсуляции составила 33,4%.

В совокупности эти результаты показывают, что эффективность инкапсуляции как одинарных, так и двойных частиц превосходит эффективность случайной инкапсуляции более чем в два раза и значительно уменьшает количество капель, которые не содержат желаемого количества клеток или частиц. Важность правильной концентрации частиц или клеток для высокой эффективности инкапсуляции проиллюстрирована в этом экспериментальном прогоне. В то время как скорость потока масла и воды такая же, как и при показанном ранее прогоне двойной инкапсуляции частиц, среднее количество ячеек на каплю лямбды уменьшается до 1,57.

Следовательно, полного упорядочивания не происходит, и поэтому в поездах появляются дыры, оставляющие солнечные капли с меньшим, чем ожидалось, количеством частиц. Эта гистограмма показывает снижение эффективности инкапсуляции двух частиц из-за более низкого значения лямбда. Для образца размером 324 капли средняя доля капель, содержащих две частицы, составила 55,9%, при этом одиночных капель почти столько же, сколько и двойных.

Это указывает на то, что лямбда должна быть равна или близка к желаемому количеству клеток на каплю, чтобы максимизировать правильно инкапсулированные частицы или ячейки с точным выбранным значением лямбда, в зависимости от того, допустимо ли меньшее или большее количество клеток в капле. В этой демонстрации мы используем несоответствие плавучести, чтобы обеспечить контроль концентрации в режиме реального времени во время эксперимента. Тем не менее, для более долгосрочных экспериментов может быть целесообразным согласование плавучести для получения более стабильных результатов после инкапсуляции клеток в водные капли.

Эксперименты, зависящие от времени, могут быть выполнены в центрифужной пробирке или под микроскопом путем повторного введения капель в микрофлюидные массивы.