Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции

Приложения, использующие клетки, инкапсулированные в каплях пиколитрового объема, часто были ограничены невозможностью контролировать количество клеток в каждой капле. В данном протоколе демонстрируется метод контроля инкапсуляции клеток путем сочетания двух различных микрофлюидных явлений: гидродинамического упорядочивания клеток и генерации капель в микросопле с фокусировкой потока. В верхнем канале обеспечивается достаточно высокая скорость потока водного раствора с суспендированными клетками или частицами, что приводит к формированию цепочек с равными интервалами в направлении потока ниже по течению.

Сопло для генерации капель с фокусировкой потока используется для формирования водных капель с частотой в несколько килогерц в допустимой масляной несущей жидкости, стабилизированной поверхностно-активными веществами. Упорядоченные цепочки частиц в ячейках затем объединяются с процессом генерации капель путем настройки скоростей потоков водной и масляной фаз, чтобы обеспечить скорость генерации капель, синхронизированную с прибытием продольно упорядоченных клеток или частиц к соплу генерации капель, при этом частицы используются в качестве заменителей клеток. Для демонстрации данного протокола скорости потоков должны быть достаточно малыми, чтобы ограничить объем жидкости.

Сдвиговые напряжения, воздействующие на биологические клетки, перекрытие процессов упорядочивания клеток и генерации капель, а также жизнеспособность клеток. Ограничения скорости водного потока обеспечивают идеальный рабочий режим для контролируемого инкапсулирования одиночных и множественных клеток. Анализ данных видеомикроскопии показывает, что эффективность инкапсулирования как одиночных, так и двойных клеток или частиц превосходит эффективность случайного инкапсулирования и значительно снижает количество капель, не содержащих требуемого числа клеток или частиц.

Локализация клеток и капель ограничивает разбавление клеточных секретов, подчеркивает гетерогенность клеток, а также позволяет контролировать межклеточные сигналы по сравнению с объемной суспензией. Эффективные способы инкапсуляции таких клеток в капли представляют собой ценный инструмент для биологов. Для начала этой процедуры разработайте схему микроканалов в программном обеспечении AutoCAD, как показано на данном рисунке.

Длинный участок канала представляет собой канал упорядочивания водного потока шириной 27 microns. На увеличенной схеме сопла показаны равные ширины канала 27 microns для канала упорядочивания водной фазы и масляного канала, за которыми следует сужение сопла до 22 microns и резкое расширение до более широкого канала шириной 61 micron. Высота устройства составляет 52 microns.

Как водный, так и масляный входы оснащены фильтрами для крупных частиц с зазорами порядка ширины упорядочивающего канала, что показано на данной увеличенной схеме масляного входа. Здесь представлено реальное изображение упорядочивающего канала и сопла, заполненных красителем. Для печати маски высокого разрешения на майларовой пленке или кварце, где каналы прозрачны на темном фоне, воспользуйтесь услугами стороннего производителя.

Затем создайте мастер-матрицу из кремния и фоторезиста SU-8 для репликационного формования. Прикрепите мастер-матрицу скотчем к дну чашки Петри для репликационного формования из PDMS. После завершения репликационного формования и вырезания контура устройства используйте биопсийный панч с внешним диаметром 0,75 мм, чтобы пробить жидкостные порты в трех круглых областях, показанных на этом рисунке; приклейте прозрачный скотч к паттернированной стороне PDMS и снимите его, чтобы удалить пыль после плазменного бондирования.

Прикрепите PDMS к чистому стеклянному предметному стеклу микроскопа. Поместите все устройство в печь и постепенно нагрейте её до 120 °C. Оставьте устройство в печи при температуре 120 °C на ночь для завершения процесса склеивания и возвращения PDMS в исходное гидрофобное состояние.

Альтернативным методом придания гидрофобности стеклянной поверхности канала является введение покрытия, такого как Aquapel, в жидкостные порты с последующей продувкой воздухом. С помощью шприца объемом 1 мл и иглы наберите несколько сотен мкл воздуха, а затем небольшое количество Aquapel, достаточное только для заполнения металлического наконечника шприца. Осторожно, но уверенно введите Aquapel, а затем продувочный воздух в жидкостные порты, стараясь не допустить агрессивного разрыва связи между PDMS и стеклом.

Повторите продувку воздухом всех входных и выходных портов, одновременно удаляя излишки воды, чтобы избежать образования осадка, который может засорить каналы при высыхании. Контроль концентрации клеток имеет решающее значение для достижения правильного соотношения количества клеток и количества капель. Эта задача состоит из двух сложных компонентов.

Первым аспектом является предварительный расчет надлежащей концентрации, а вторым — поддержание этой концентрации в ходе эксперимента. Для конкретного устройства, использованного в данном исследовании, клеток или частиц размером от 8 до 15 микрон должно быть достаточно для контролируемого инкапсулирования. В данной демонстрации в качестве имитаторов клеток будут использованы полистирольные микросферы размером 9.9 микрон. Чтобы подготовить водную суспензию частиц для достижения идеального инкапсулирования, начните с исходной концентрации микросфер 1% твердой фазы по весу, используя предыдущие данные для полного упорядочивания. В качестве рекомендации увеличьте концентрацию до 1.5% твердой фазы, осторожно центрифугируя один миллилитр исходного образца, удаляя 250 µL супернатанта и повторно суспендируя частицы с помощью вортексного или более мягкого перемешивания.

При использовании клеток следует учитывать, что и клетки, и полистироловые частицы имеют удельный вес более единицы, хотя в данном видео это не показано. Для длительных экспериментов, продолжительностью от нескольких минут до нескольких часов, можно сбалансировать плавучесть раствора путем добавления такого растворенного вещества, как хлорид кальция для частиц или OptiPrep для клеток. После приготовления суспензии клеток или частиц подготовьте образец непрерывной фторуглеродной жидкой фазы объемом 10 milliliter в центрифужной пробирке объемом 15 milliliter и перемешайте на вортексе.

Смешайте поверхностно-активное вещество и фторсодержащее масло в соотношении приблизительно 2,5% по массе. В данном случае мы получили смесь с массовой долей 2,4%, что допустимо для постановки эксперимента по микроинкапсуляции. Сначала включите питание инвертированного оптического микроскопа и высокоскоростной камеры.

Сфокусируйтесь на слое микроканалов и осмотрите их на наличие засоров и любых частиц мусора, которые могут переместиться. Выберите канал, свободный от крупных частиц мусора или явных засоров. Отрежьте три отрезка полупрозрачной ПВХ-трубки Tigon для входа водной фазы, входа масла и выхода эмульсии, чтобы минимизировать мертвый объем.

Отрежьте трубку длиной, достаточной для соединения шприцевых насосов с микроскопом. Срежьте концы трубки под углом 45 градусов. Чтобы облегчить установку в жидкостные порты, с помощью пинцета плотно вставьте концы трубок в эти порты. Затем плотно вставьте стальную иглу для шприца с тупым концом калибра 30 G в свободный конец трубки подачи водного раствора.

Повторите процедуру для трубки подачи масла. Переместите устройство и закрепите трубки на предметном столике микроскопа, используя объектив с 20-кратным увеличением, выровняйте и сфокусируйте изображение на сопле устройства. Вручную настройте микроскоп по методу Кёлера для обеспечения оптимального освещения в фокальной плоскости.

С помощью программного обеспечения высокоскоростной камеры обрежьте область обзора вокруг сопла, чтобы обеспечить более высокую частоту кадров, а затем установите частоту кадров, время экспозиции и другие параметры камеры, необходимые для оптимальной записи. Затем наполните одномиллилитровый шприц предварительно подготовленным и хорошо перемешанным раствором водной фазы. Наполните трехмиллилитровый шприц раствором масляной фазы.

Наклоните один из заполненных шприцев вертикально и слегка постучите по нему, чтобы переместить пузырьки воздуха к выходному отверстию шприца. Удерживая шприц вертикально, медленно нажимайте на поршень до тех пор, пока воздух не выйдет к кончику шприца. Подсоедините шприц к соответствующей игле, уже установленной на устройстве.

Нажмите на поршень, чтобы вытеснить воздух из мертвого объема иглы шприца, пока жидкость не продвинется по трубке почти до самого устройства. Надежно закрепите шприц в шприцевом насосе и зафиксируйте блок поршня. Повторите процедуру подключения для второго шприца и установите его во второй шприцевой насос. Включите каждый шприцевой насос и запрограммируйте их. Согласно протоколам производителя, установите начальную скорость потока 50 microliters per minute для масляной фазы и five microliters per minute для водной.

При запуске водной фазы насосы подают каждую жидкость в устройство до полного заполнения каналов и вытеснения остатков воздуха. При использовании начальных скоростей потока этот процесс может занять несколько минут. Следите за образованием капель на сопле.

Медленно увеличивайте скорость потока водной фазы, чтобы наблюдать упорядочивание частиц в длинном канале с водным раствором. По мере увеличения скорости потока следите за тем, чтобы она не достигла значения, при котором в сопле возникает струйный режим потока водной фазы, как показано в данном примере с использованием другого сопла для генерации капель; обратите внимание на нестабильный поток и неоднородный размер капель. Если концентрация частиц слишком низка для формирования чередующихся цепочек с относительно небольшим количеством пропусков, а плотность образца не согласована с плотностью среды, физически наклоните шприцевой насос в сторону выходного отверстия шприца, чтобы обеспечить постепенное осаждение частиц к выходу из шприца.

После достижения надлежащего упорядочивания отрегулируйте скорость потока масла, чтобы настроить частоту генерации и размер капель. Итеративно корректируйте обе скорости потока для достижения желаемой степени инкапсуляции и объема капель. После подтверждения стабильной упорядоченной инкапсуляции переместите выпускную трубку из резервуара для отходов в резервуар для сбора для последующего использования.

Высокая эффективность инкапсуляции одиночных и двойных частиц или клеток может быть достигнута при соблюдении данного протокола. В качестве репрезентативного результата инкапсуляции одиночных частиц при скорости потока масла 60 µL/min и скорости водного потока 9 µL/min приведены данные, показанные здесь. Значение лямбда, представляющее собой среднее количество частиц на каплю, составляет 0,95.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет примерно 17–18 микрон для полностью упорядоченных чередующихся частиц. Скорость генерации капель в данном примере составляет 6,1 килогерц при среднем объеме капли 24,4 пиколитра. Гистограмма сравнивает эффективность инкапсуляции частиц в каплях при упорядоченном расположении с инкапсуляцией одной частицы и более чем одной частицей.

Что касается статистики, при случайном инкапсулировании для выборки из 517 капель средняя доля капель, содержащих одну частицу, составила 79,5%, по сравнению с прогнозируемой долей случайного инкапсулирования 36,7%. Было отмечено, что доля частиц, оказавшихся в правильно инкапсулированных каплях, составила 83,7% для выборки из 491 частицы, в то время как доля случайного инкапсулирования составила 37,3%. Инкапсулирование двух частиц достигается простым снижением скорости потока масла до 30 µL/min при поддержании скорости водного потока на уровне 9 µL/min. В данном случае lambda, среднее количество частиц на каплю, составляет 1,8. Процесс аналогичен инкапсулированию одной частицы.

Расстояние между частицами в направлении потока составляет примерно 17–18 микрон для полностью упорядоченных чередующихся частиц. Более крупные капли имеют средний объем 39.8 пиколитров и формировались с частотой 3.8 килогерц по сравнению со случайным инкапсулированием. Для выборки из 383 капель средняя доля капель с упорядоченным инкапсулированием, содержащих две частицы, составила 71.5% по сравнению с прогнозируемой долей при случайном инкапсулировании, которая составила 26.8%. Было отмечено, что доля частиц, оказавшихся в правильно инкапсулированных каплях, составила 79.5% для выборки из 689 частиц, тогда как доля при случайном инкапсулировании составила 33.4%.

В совокупности эти результаты показывают, что эффективность инкапсуляции как одной, так и двух частиц более чем в два раза превышает эффективность случайной инкапсуляции и значительно сокращает количество капель, не содержащих требуемого числа клеток или частиц. Важность правильной концентрации частиц или клеток для достижения высокой эффективности инкапсуляции проиллюстрирована в данном экспериментальном прогоне. Хотя скорость потоков масла и водной фазы такая же, как и в ранее показанном прогоне по инкапсуляции двух частиц, среднее количество клеток на каплю lambda снижено до 1.57.

Следовательно, полное упорядочивание не происходит, и в цепочках возникают разрывы, в результате чего в каплях оказываются частицы в количестве меньшем, чем ожидалось. На данной гистограмме показано снижение эффективности инкапсуляции двух частиц из-за более низкого значения Lambda. При размере выборки в 324 капли средняя доля капель, содержащих две частицы, составила 55.9%, при этом количество капель с одной частицей было почти таким же, как и количество капель с двумя частицами.

Это указывает на то, что значение Lambda должно быть равно или близко к количеству желаемых клеток в одной капле для максимизации числа правильно инкапсулированных частиц или клеток; при этом точное значение lambda выбирается в зависимости от того, допустимо ли меньшее или большее количество клеток в капле. В данной демонстрации мы используем разницу в плавучести для обеспечения контроля концентрации в режиме реального времени в ходе эксперимента. Однако для длительных экспериментов может быть целесообразно обеспечить согласование плавучести для получения более стабильных результатов после инкапсуляции клеток в водные капли.

Эксперименты с временной зависимостью можно проводить в центрифужной пробирке или под микроскопом, повторно вводя капли в микрофлюидные матрицы.