Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома
23 мая 2018 г.
Секвенирование одной ячейки показывает генотипическая гетерогенность в биологических системах, но современные технологии не хватает пропускной способности, необходимые для глубокого профилирования сообщества состав и функции. Здесь мы описываем microfluidic рабочего процесса для секвенирования > 50,000 одноклеточных геномов из различных мобильных популяций.
Общая цель этого эксперимента заключается в получении данных секвенирования генома со штрих-кодом из десятков тысяч отдельных клеток с помощью серии микрофлюидных устройств. Этот метод обеспечивает беспрецедентную производительность секвенирования отдельных клеток. Мы используем микрофлюидики для инкапсуляции, лизирования и штрихкодирования клеток по отдельности, сохраняя основную геномную гетерогенность, которая теряется при обычном шоке в исследованиях секвенирования.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает высокой пропускной способностью и способна производить данные по одной ячейке из десятков тысяч ячеек. Несмотря на то, что в этой демонстрации мы работаем с микробами, рабочий процесс может быть адаптирован для использования с различными типами клеток путем незначительных изменений размеров микрофлюидного устройства. Чтобы начать протокол, приготовьте один миллилитр 3% веса на объем низкоплавкой агарозы в 1X Tris-EDTA, или TE, буфере.
Держите агарозный раствор на нагревательном блоке при температуре 90 градусов Цельсия до загрузки шприца. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре фосфатно-солевого буфера, или PBS, и вращайте клетки. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре градиента плотности 17% объема к объемной плотности среды в PBS и держите клетки на льду до тех пор, пока шприц не загрузится.
Затем загрузите трехмиллилитровый шприц фторированным маслом (HFE), содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 2% веса на вес. Установите на него иглу 27-го калибра и поместите в шприцевой насос. Загрузите клеточную суспензию и расплавленный агарозу в одномиллилитровые шприцы, оба из которых оснащены иглами 27-го калибра, и поместите их в шприцевые насосы.
Затем установите обогреватель на высокую мощность и расположите нагревательную поверхность на расстоянии 10 сантиметров от шприца. Следите за тем, чтобы измеренная на шприце температура составляла примерно 80 градусов по Цельсию. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали.
Подсоедините иглы шприца к входным отверстиям микрофлюидного устройства с помощью кусочков полиэтиленовой или полиэтиленовой трубки. Подсоедините кусок трубки к выходному отверстию, а свободный конец поместите в 15-миллилитровую сборную трубку. После дропмейкинга поместите пробирку для сбора при температуре четыре градуса Цельсия на 30 минут, чтобы обеспечить полное гелеобразование агарозы.
Удалите нижний слой масла из сборной трубки с помощью трехмиллилитрового шприца, оснащенного иглой 20-го калибра, стараясь не повредить верхний слой агарозных капель. Добавьте один миллилитр 10% объема PFO в HFE, чтобы удалить капли агарозы из слоя поверхностно-активного вещества. Пипеткой распыляйте раствор вверх и вниз в течение одной минуты, чтобы тщательно покрыть эмульсии, которые должны быть однородными и не иметь комочков.
Вращайте коническую трубку со скоростью 2 000 г в течение одной минуты, чтобы собрать агарозные микрогели. Аспирируйте надосадочную жидкость PFO/HFE и убедитесь, что микрогели теперь свободны от слоя поверхностно-активного вещества и являются прозрачными. После промывки микрогелей проверьте инкапсуляцию клеток в микрогелях под микроскопом при 400-кратном увеличении, окрашивая 10-микролитровую аликвоту гелей 1-кратным окрашиванием нуклеиновой кислоты.
Заглушите входное отверстие ячейки соточного капельного устройства с помощью небольшого кусочка свинцового припоя. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините кусок трубки к выходному отверстию, а свободный конец поместите в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку.
Используйте скорость потока на экране для дропмейкинга. Соберите капли в пробирки для ПЦР примерно по 50 микролитров капель в каждой пробирке. После дропмейкинга осторожно удалите нижний слой масла HFE из эмульсий с помощью наконечников пипеток с загрузкой геля и замените его фторированным маслом FC-40, содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 5% от веса.
Затем запрограммируйте тепловой цикл. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините шприцы, содержащие HFE, смесь для мечения и микрогели, к входным отверстиям микрофлюидного устройства с помощью кусочков полиэтиленовой трубки.
Подсоедините кусок трубки к выпускному отверстию и поместите свободный конец в пустой одномиллилитровый шприц с поршнем, подтянутым к отметке в один миллилитр. Затем проверьте скорость инкапсуляции микрогеля под световым микроскопом при 400-кратном увеличении. Поместите шприц, содержащий эмульсии для мечения, с иглой и инкубируйте его в вертикальном положении в нагревательном блоке или духовке в течение одного часа при температуре 55 градусов Цельсия, чтобы фрагментировать геномную ДНК.
Подготовьте капли штрих-кода к слиянию, заменив масляную фракцию FC-40 на HFE 2% веса на вес PFPE-PEG. Осторожно переложите капли в одномиллилитровый шприц, подогните к нему иглу, и поместите в шприцевую помпу. Загрузите инкубированный и меченый шприц с микрогелевыми каплями в шприцевой насос.
Затем подсоедините три шприца с хлоридом натрия к двум входным отверстиям электродов и одному входу рва с помощью отрезков полиэтиленовой трубки. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините три шприца HFE, установленные на насосах, к двум распорным входным отверстиям для масла и входу капельного масла с помощью отрезков полиэтиленовых трубок.
Затем прострелите все трубки для повторного впрыска с помощью антистатического пистолета, прежде чем подсоединить трубку к иглам шприца. Подсоедините шприц для смеси ПЦР, шприц с микрогелевыми каплями и шприц со штрих-кодом к соответствующим входным отверстиям с помощью полиэтиленовой трубки. Подсоедините иглу электродного шприца к флуоресцентному инвертору с холодным катодом с помощью зажима типа «крокодил».
Установите источник питания постоянного тока инвертора на два вольта. Запустите устройство двойного слияния с рекомендуемыми расходами. Соберите капли в пробирки для ПЦР с примерно 50 микролитрами эмульсии в каждой пробирке.
Перед термоциклированием осторожно удалите нижний слой масла HFE из эмульсий с помощью наконечников пипеток с гелевым наполнением и замените их фторированным маслом FC-40, содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 5% веса на вес. Затем запрограммируйте цикл. Чтобы извлечь ДНК из капель термического цикла, объедините капли в микроцентрифужную пробирку и разбейте эмульсии, используя 20 микролитров PFO.
Встряхнитеих на 10 секунд для перемешивания. Вращаем трубку. Осторожно удалите верхний водный слой из пробирки с помощью пипетки, и перенесите его в новую микроцентрифужную пробирку.
Выбросьте масляную фазу. Затем, наконец, перейдите к этапам подготовки библиотеки, секвенирования и анализа. Гистограмма количества штрихкодов в зависимости от размера группы показывает, что значительная часть действительных групп штрихкодов чуть превышает пороговый размер 7,5 килобазовых пар на группу, что исключает сирот, мутировавших в результате ПЦР.
Относительная численность типов клеток из синтетического 10-клеточного сообщества, состоящего из трех грамотрицательных бактерий, пяти грамположительных бактерий и двух дрожжей, была рассчитана путем подсчета необработанных прочтений и групп штрих-кодов. Круговая карта покрытия считываний B.subtilis из всех групп штрих-кодов иллюстрирует равномерность считывания SiC-seq, без наблюдаемых областей выпадения, где среднее покрытие составило 5,55X. Равномерность покрытия была проверена с помощью частотного распределения нормализованных значений покрытия.
При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать скорость инкапсуляции около одного штрих-кода или ячейки на каждые 10 капель. Это ограничивает вероятность события двойной инкапсуляции, которое может свернуть данные одной ячейки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настраивать и эксплуатировать микрофлюидные устройства, используемые для генерации данных секвенирования одиночных клеток.
После освоения этой техники ее можно запускать за восемь часов или за два четырехчасовых дня.
Обзор
В данном исследовании представлен микрофлюидный рабочий процесс для секвенирования более 50 000 геномов отдельных клеток, что позволяет преодолеть ограничения современных технологий при профилировании состава и функций сообществ. Метод сохраняет геномную гетерогенность за счет индивидуальной инкапсуляции и штрихкодирования клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Геномика единичных клеток
- Микрофлюидика
- Геномное секвенирование
Теоретические основы
- Секвенирование отдельных клеток выявляет генотипическую неоднородность.
- Современным технологиям не хватает пропускной способности для глубокого профилирования.
- Микрофлюидика может расширить возможности секвенирования.
- Сохранение геномной неоднородности имеет решающее значение для точности анализа.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод секвенирования единичных клеток.
- Продемонстрировать адаптивность рабочего процесса для различных типов клеток.
- Осуществить инкапсуляцию и штрихкодирование клеток при сохранении целостности генома.
Используемые методы
- Приготовление агарозы и клеточной суспензии для микрофлюидных устройств.
- Инкапсуляция и лизис отдельных клеток в микрогелях.
- Баркодирование геномной ДНК с помощью тагментации.
- Термоциклирование для извлечения ДНК из эмульсий.
Основные результаты
- Успешно проведено секвенирование геномов десятков тысяч отдельных клеток.
- Продемонстрирована высокая пропускная способность и эффективность микрофлюидного рабочего процесса.
- Под микроскопом подтверждено инкапсулирование клеток в микрогелях.
- Подтверждена адаптивность метода для различных типов клеток.
Выводы
- Микрофлюидный рабочий процесс значительно расширяет возможности секвенирования единичных клеток.
- Данный метод позволяет сохранить геномную гетерогенность, что крайне важно для точного профилирования.
- В будущем область применения метода может быть расширена с микроорганизмов на различные типы клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Секвенирование генома отдельных клеток позволяет проводить деконволюцию гетерогенных популяций, что является критически важной возможностью для валидации мишеней в моделях сложных заболеваний. Платформа SiC-seq обеспечивает сверхвысокую пропускную способность (>50 000 клеток за запуск) при сохранении целостности генома, что напрямую поддерживает масштабируемые рабочие процессы поиска новых мишеней. Это позволяет использовать данный метод в качестве прогностического инструмента по снижению рисков при ранней идентификации мишеней в микробных и млекопитающих системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем разрешения геномной гетерогенности в смешанных популяциях.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет использования штрихкодирования для анализа связей между генотипом и фенотипом на уровне отдельных клеток.
- Прогностическая ценность: снижает механистическую неопределенность, обеспечивая несмещенные геномные данные по тысячам клеток с низким уровнем систематической ошибки.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: формирует стандартизированные результаты секвенирования с демультиплексированием по штрих-кодам, подходящие для количественных скрининговых кампаний.
- Масштабируемость: микрофлюидный смеситель обеспечивает сопряжение геномов с уникальными олигонуклеотидами, что позволяет воспроизводимо подготавливать библиотеки высокой плотности.
- Повторное использование платформы: адаптируемый рабочий процесс позволяет работать с различными типами клеток за счет модификации размеров устройства, что расширяет возможности применения метода в разных проектах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Равномерное покрытие и низкий уровень выпадения данных (подтвержденный распределением частот нормированного покрытия) обеспечивают надежную экстраполяцию результатов от этапа открытия к доклиническим моделям.
- Системы, релевантные заболеванию: Применимость к различным клеточным популяциям, включая синтетические сообщества, позволяет моделировать сложные микробиомы или тканевые ниши.
- Прогресс с учетом рисков: Высокопроизводительные данные обеспечивают статистическую достоверность распространенности и гетерогенности мишеней, что служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
Интеграция в технологический процесс и рабочий процесс
Метод SiC-seq интегрируется в непрерывный процесс исследований — от проверки гипотез до идентификации перспективных мишеней, что особенно важно для целей, требующих разрешения на уровне отдельных клеток. Он обеспечивает масштабируемую подготовку валидированных биологических систем для последующего анализа и скрининга.
- Открытия в биологии: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков за счет изоляции и штрихкодирования геномов отдельных клеток.
- Скрининг: предоставляет количественные данные секвенирования, готовые к анализу, с определенными порогами (например, >7.5 kbp/group) для фильтрации артефактов.
- Аналитика: генерирует демультиплексированные группы чтений и показатели покрытия (например, среднее 5.55X), что позволяет проводить сравнительный анализ условий.
- Трансляционные исследования: равномерное покрытие и адаптивность к различным типам клеток обеспечивают преклиническую преемственность в соответствии с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: конструкция микрофлюидной платформы позволяет стандартизировать процессы в различных проектах, снижая затраты на повторную валидацию.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет высокопроизводительного геномного профилирования одиночных клеток с низким уровнем систематической ошибки.
- Операционная ценность: Стандартизация процессов посредством микрофлюидного инкапсулирования, штрихкодирования и этапов термического циклирования.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе статистически надежного анализа клеточной гетерогенности.
- Влияние на портфель проектов: Приоритизация с учетом рисков, ставшая возможной благодаря всестороннему секвенированию геномов одиночных клеток в крупных популяциях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрофлюидными устройствами, калибровкой шприцевых насосов и флуоресцентной микроскопией для проверки инкапсуляции.
- Зависимость от специализированных реагентов: низкоплавкого агарозы, сред для градиента плотности, фторированных масел (HFE, PFO, FC-40), сурфактантов (PFPE-PEG) и смесей для тагментации.
- Необходима инфраструктура для термического циклирования и оборудование для работы с эмульсиями (например, наконечники для загрузки геля, вортексы, центрифуги).
- Адаптация метода для клеток млекопитающих или первичных клеток может потребовать оптимизации лизиса, тагментации и эффективности инкапсуляции.
- Практическое ограничение: поддержание соотношения ~1 клетка/штрихкод на 10 капель для минимизации количества дуплетов и сохранения целостности данных единичных клеток.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Encapsulation of Cells in Agarose Microgels
2:48
Breaking the Agarose Microgels
3:54
Generating Barcode Droplets by Digital PCR
4:53
Tagmentation of Genomic DNA in Droplets
5:48
Single-cell Barcoding by Microfluidic Double Merger
8:25
Results: Ultrahigh Throughput Sequencing of Single-cell Genomes
9:24
Conclusion
