Microfluidic платформа сверхвысокой пропускной способности для одной ячейки генома

Общая цель этого эксперимента заключается в получении данных секвенирования генома со штрих-кодом из десятков тысяч отдельных клеток с помощью серии микрофлюидных устройств. Этот метод обеспечивает беспрецедентную производительность секвенирования отдельных клеток. Мы используем микрофлюидики для инкапсуляции, лизирования и штрихкодирования клеток по отдельности, сохраняя основную геномную гетерогенность, которая теряется при обычном шоке в исследованиях секвенирования.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает высокой пропускной способностью и способна производить данные по одной ячейке из десятков тысяч ячеек. Несмотря на то, что в этой демонстрации мы работаем с микробами, рабочий процесс может быть адаптирован для использования с различными типами клеток путем незначительных изменений размеров микрофлюидного устройства. Чтобы начать протокол, приготовьте один миллилитр 3% веса на объем низкоплавкой агарозы в 1X Tris-EDTA, или TE, буфере.

Держите агарозный раствор на нагревательном блоке при температуре 90 градусов Цельсия до загрузки шприца. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре фосфатно-солевого буфера, или PBS, и вращайте клетки. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре градиента плотности 17% объема к объемной плотности среды в PBS и держите клетки на льду до тех пор, пока шприц не загрузится.

Затем загрузите трехмиллилитровый шприц фторированным маслом (HFE), содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 2% веса на вес. Установите на него иглу 27-го калибра и поместите в шприцевой насос. Загрузите клеточную суспензию и расплавленный агарозу в одномиллилитровые шприцы, оба из которых оснащены иглами 27-го калибра, и поместите их в шприцевые насосы.

Затем установите обогреватель на высокую мощность и расположите нагревательную поверхность на расстоянии 10 сантиметров от шприца. Следите за тем, чтобы измеренная на шприце температура составляла примерно 80 градусов по Цельсию. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали.

Подсоедините иглы шприца к входным отверстиям микрофлюидного устройства с помощью кусочков полиэтиленовой или полиэтиленовой трубки. Подсоедините кусок трубки к выходному отверстию, а свободный конец поместите в 15-миллилитровую сборную трубку. После дропмейкинга поместите пробирку для сбора при температуре четыре градуса Цельсия на 30 минут, чтобы обеспечить полное гелеобразование агарозы.

Удалите нижний слой масла из сборной трубки с помощью трехмиллилитрового шприца, оснащенного иглой 20-го калибра, стараясь не повредить верхний слой агарозных капель. Добавьте один миллилитр 10% объема PFO в HFE, чтобы удалить капли агарозы из слоя поверхностно-активного вещества. Пипеткой распыляйте раствор вверх и вниз в течение одной минуты, чтобы тщательно покрыть эмульсии, которые должны быть однородными и не иметь комочков.

Вращайте коническую трубку со скоростью 2 000 г в течение одной минуты, чтобы собрать агарозные микрогели. Аспирируйте надосадочную жидкость PFO/HFE и убедитесь, что микрогели теперь свободны от слоя поверхностно-активного вещества и являются прозрачными. После промывки микрогелей проверьте инкапсуляцию клеток в микрогелях под микроскопом при 400-кратном увеличении, окрашивая 10-микролитровую аликвоту гелей 1-кратным окрашиванием нуклеиновой кислоты.

Заглушите входное отверстие ячейки соточного капельного устройства с помощью небольшого кусочка свинцового припоя. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините кусок трубки к выходному отверстию, а свободный конец поместите в 0,2-миллилитровую ПЦР-пробирку.

Используйте скорость потока на экране для дропмейкинга. Соберите капли в пробирки для ПЦР примерно по 50 микролитров капель в каждой пробирке. После дропмейкинга осторожно удалите нижний слой масла HFE из эмульсий с помощью наконечников пипеток с загрузкой геля и замените его фторированным маслом FC-40, содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 5% от веса.

Затем запрограммируйте тепловой цикл. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините шприцы, содержащие HFE, смесь для мечения и микрогели, к входным отверстиям микрофлюидного устройства с помощью кусочков полиэтиленовой трубки.

Подсоедините кусок трубки к выпускному отверстию и поместите свободный конец в пустой одномиллилитровый шприц с поршнем, подтянутым к отметке в один миллилитр. Затем проверьте скорость инкапсуляции микрогеля под световым микроскопом при 400-кратном увеличении. Поместите шприц, содержащий эмульсии для мечения, с иглой и инкубируйте его в вертикальном положении в нагревательном блоке или духовке в течение одного часа при температуре 55 градусов Цельсия, чтобы фрагментировать геномную ДНК.

Подготовьте капли штрих-кода к слиянию, заменив масляную фракцию FC-40 на HFE 2% веса на вес PFPE-PEG. Осторожно переложите капли в одномиллилитровый шприц, подогните к нему иглу, и поместите в шприцевую помпу. Загрузите инкубированный и меченый шприц с микрогелевыми каплями в шприцевой насос.

Затем подсоедините три шприца с хлоридом натрия к двум входным отверстиям электродов и одному входу рва с помощью отрезков полиэтиленовой трубки. Прежде чем вставлять трубки в устройство, подготовьте насосы, чтобы удалить воздух из магистрали. Подсоедините три шприца HFE, установленные на насосах, к двум распорным входным отверстиям для масла и входу капельного масла с помощью отрезков полиэтиленовых трубок.

Затем прострелите все трубки для повторного впрыска с помощью антистатического пистолета, прежде чем подсоединить трубку к иглам шприца. Подсоедините шприц для смеси ПЦР, шприц с микрогелевыми каплями и шприц со штрих-кодом к соответствующим входным отверстиям с помощью полиэтиленовой трубки. Подсоедините иглу электродного шприца к флуоресцентному инвертору с холодным катодом с помощью зажима типа «крокодил».

Установите источник питания постоянного тока инвертора на два вольта. Запустите устройство двойного слияния с рекомендуемыми расходами. Соберите капли в пробирки для ПЦР с примерно 50 микролитрами эмульсии в каждой пробирке.

Перед термоциклированием осторожно удалите нижний слой масла HFE из эмульсий с помощью наконечников пипеток с гелевым наполнением и замените их фторированным маслом FC-40, содержащим поверхностно-активное вещество PFPE-PEG весом 5% веса на вес. Затем запрограммируйте цикл. Чтобы извлечь ДНК из капель термического цикла, объедините капли в микроцентрифужную пробирку и разбейте эмульсии, используя 20 микролитров PFO.

их на 10 секунд для перемешивания. Вращаем трубку. Осторожно удалите верхний водный слой из пробирки с помощью пипетки, и перенесите его в новую микроцентрифужную пробирку.

Выбросьте масляную фазу. Затем, наконец, перейдите к этапам подготовки библиотеки, секвенирования и анализа. Гистограмма количества штрихкодов в зависимости от размера группы показывает, что значительная часть действительных групп штрихкодов чуть превышает пороговый размер 7,5 килобазовых пар на группу, что исключает сирот, мутировавших в результате ПЦР.

Относительная численность типов клеток из синтетического 10-клеточного сообщества, состоящего из трех грамотрицательных бактерий, пяти грамположительных бактерий и двух дрожжей, была рассчитана путем подсчета необработанных прочтений и групп штрих-кодов. Круговая карта покрытия считываний B.subtilis из всех групп штрих-кодов иллюстрирует равномерность считывания SiC-seq, без наблюдаемых областей выпадения, где среднее покрытие составило 5,55X. Равномерность покрытия была проверена с помощью частотного распределения нормализованных значений покрытия.

При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать скорость инкапсуляции около одного штрих-кода или ячейки на каждые 10 капель. Это ограничивает вероятность события двойной инкапсуляции, которое может свернуть данные одной ячейки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настраивать и эксплуатировать микрофлюидные устройства, используемые для генерации данных секвенирования одиночных клеток.

После освоения этой техники ее можно запускать за восемь часов или за два четырехчасовых дня.