Высокопроизводительная технология сортировки циркулирующих опухолевых клеток и секвенирования одиночных клеток на основе микрофлюидики

Мы сосредоточены на разработке высокоэффективных методов изоляции и анализа CTC для продвижения точной онкологии с помощью жидкостной биопсии. Современные коммерческие изоляционные платформы CTC обладают низкой пропускной способностью и эффективностью. Они также несовместимы с платформами анализа, что ограничивает восстановление биологической информации.

В этом исследовании используется микрофлюидная CTC-изоляционная платформа для значительного повышения частоты обнаружения. Мы также применяем редкоклеточный чип секвенирования отдельных клеток для более глубокого анализа жидкостной биопсии. Для начала пипетка 25 микролитров промытых и ревзвешенных магнитных шариков с помощью стрептавидина вложите в пробирку с одним микрограммом биотинилированного антитела EpCAM.

Инкубировать смесь при комнатной температуре, вращая её со скоростью 20 оборотов в минуту в течение 40 минут, чтобы подготовить иммуномагнитные шарики. С помощью магнитной стойки отделите бусины от супернатанта. После удаления супернатанта подвесьте шарики в 25 микролитрах изоляционного буфера.

Пипетте 20 микролитров подвески магнитного шарика за одну-две секунды, чтобы избежать появления воздушных пузырьков. Сразу же поставьте чип вертикально на магнит и дайте шарикам осесть пять минут без помех. Соберите четыре миллилитра образца крови в шприц, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Запечатайте вход и выход чипа жидкостью, чтобы устранить пузырьки воздуха, затем вставьте впуск и выход проба в чип. С помощью шприцового насоса вводите образец со скоростью потока 1,5 миллилитра в час. После загрузки образца введите 60 микролитров DPBS в чип HB с расходом 0,2 миллилитра в час, чтобы смыть несвязанные клетки.

Удалите магнит и вручную введите 1,5 миллилитра 5% BSA, чтобы промыть чип и высвободить захватывающие опухолевые клетки. Приготовьте раствор с 10% MPTS в этаноле. Немедленно введите 20 микролитров раствора в чип HB и инкубируем при комнатной температуре в течение одного часа.

Промыйте чип HB один раз безводным этанолом, затем высушите при 100 градусах Цельсия в течение часа. Затем приготовьте раствор GMBS в этаноле с концентрацией 0,5 миллиграмма на миллилитр. После охлаждения чипа до 37 градусов Цельсия введите раствор GMBS и инкубируете.

Ополосните чип HB дважды двойной дистиллированной водой, затем дважды промывайте DPBS. Сразу же добавьте 15 микрограмм стрептавидина на миллилитр в чип HB и инкубуйте при комнатной температуре в течение часа или ночью при 4 градусах Цельсия. После инкубации промыйте HB-чип два раза физиологическим раствором DPBS.

Теперь подготовьте буфер антител CD45, добавив 0,2% BSA и 20 микрограмм на миллилитр биотинилированного антитела CD45 к DPBS, и скорректируя к конечному объёму. Введите 20 микролитров буфера антител CD45 в HB-чип для отрицательного отбора лейкоцитов. После часовой инкубации при комнатной температуре прополосните чип DPBS.

Добавьте в чип HB блокирующий раствор, содержащий 3% BSA и 0,05% Tween 20. Всадите подготовленный образец в шприц, убедившись, что нет воздушных пузырьков. Затем герметизируйте вход и выход чипа жидкостью и подключите трубки входа и выхода к чипу.

С помощью шприцового насоса введите образец с расходом 0,6 миллилитра в час. Собирайте очищенные опухолевые клетки из выхода чипа для подсчёта и секвенирования отдельных клеток. Pipette 200 микролитров раствора 0,5% F-68, приготовленных в DPBS, в воздухозаборник чипа.

Проводите звуковое соуникание в водяной бане, держа чип. Когда пузырьки видны в микропористом участке, продолжайте соникацию в течение 30 секунд, чтобы удалить пузырьки из двойных ямак. Далее введите 200 микролитров суспензии опухолевых клеток в чип, содержащий 60 000 двойных ямак.

Аккуратно подведите подвеску ячейки в чипе дважды вверх и вниз. Затем снова поставьте на шейкер для обезцветления на пять минут, чтобы вновь подвесить незахваченные клетки и дать им снова осесть. Теперь добавьте 200 микролитров DPBS и 0,5% раствора F-68 через вход и аспирацию от выхода.

После повторного подвески с штрихкодом немедленно впрысните 200 микролитров подвески во вход чипа и встряхните со скоростью 10 оборотов в минуту в течение 20 секунд. Аккуратно подвесите бусину пипеткой дважды, прежде чем снова положить на шейкер. Теперь извлекайте штрих-кодовую подвеску с шариком из выхода, затем пипеткой 200 микролитров раствора 20X Tris-EDTA и 50 миллимолярных дитиотрейтолов.

Забирайте жидкость из выхода. Для лизиса клеток и захвата МРНК медленно добавляйте 200 микролитров буфера для лизиса клеток во вход чипа. Сразу добавьте 200 микролитров минерального масла, чтобы герметизировать двойные скважины.

Удалите раствор, стекающий из выхода чипа в резервуар для отходов. Затем положите чип горизонтально и оставьте при комнатной температуре пять минут. Медленно добавьте 200 микролитров 6-кратного солевого раствора цитрата натрия в воздухозаборник.

Удалите отходную жидкость и аспирируйте оставшийся раствор из выхода чипа. Медленно добавляйте 200 микролитров 6-кратного солевого раствора цитрат натрия, чтобы заполнить чип. Держите магнит рядом с поверхностью чипа и медленно перемещайте его от входа к выходу, чтобы собрать штрих-коды шариков.

Быстро аспирировать раствор и шарики в центрифугную трубку с 6X солевым цитратом натрия. Промой шарики с штрихкодом три раза 200 микролитрами 6X солевого раствора цитра натрия, затем один раз с буфером обратной транскрипции. Равномерное распределение иммуномагнитных шариков наблюдалось под магнитным полем, а минимальные остаточные шарики после удаления магнитом подтвердили успешное высвобождение.

Чип изоляции CTC эффективно захватил опухолевые клетки как из образцов объемом 1 миллилитр, так и с 10 миллилитров. Добавление чипа для очистки ещё больше повысило чистоту опухолевых клеток. В периферических образцах крови с минимальным количеством LNCaP-клеток система сортировки CTC поддерживала высокую эффективность захвата и чистоту.

Чип с одноэлементным штрих-кодированием достиг коэффициента заполненности ячеек 85,6% и 95,7% штрих-кодированных шариков, что привело к скорости парирования 81,9%. Увеличение числа загруженных ячеек улучшило коэффициент заполненности микроскважин, не снижая эффективность захвата. Интегрированный процесс изоляции CTC и секвенирования отдельных клеток позволил получить высокочистые опухолевые клетки и точно сохранить исходные соотношения опухолевых клеток. Анализ TSNE чётко разделил клетки PC3, LNCaP и Jurkat на три кластера, каждый из которых отличается уникальной экспрессией маркеров.

Кластер клеток Jurkat был идентифицирован по сильной экспрессии TRBC1, IGLL1, CD1E и CD3D, что подтверждалось обогащением путей для активации Т-клеток. Кластеры PC3 и LNCaP отличались дифференциально экспрессированными генами, при этом PC3 демонстрировал высокую экспрессию микросеминопротеинов, а LNCaP — NEDD4.