Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток

Общая цель этой процедуры заключается в сборке и использовании полуавтоматической микрофлюидной платформы для культивирования и стимуляции небольших популяций клеток и восстановления клеточных лизатов для молекулярного анализа. Это достигается путем создания микромасштабных клеточных культур в микрокапиллярах, покрытых фибронектином, называемых камерами перфузии клеток. Вторым шагом является подключение перфузионных камер к цифровому модулю микрофлюидики или DMF, который обеспечивает гибкие средства для направления реагентов к микромасштабным культурам клеток и от них.

Затем модуль DMF подает интересующий вас стимул в перфузионные камеры, и клетки инкубируются с этим стимулом в течение заданного времени воздействия. Наконец, клетки лизируются химическим путем, и лизаты восстанавливаются на модуле DMF для молекулярного анализа. Затем восстановленные лизаты анализируют с использованием количественного R-T-P-C-R для того, чтобы охарактеризовать транскрипционный ответ клеточной популяции на стимул.

Основное преимущество этой методики перед традиционными методами культивирования клеток заключается в том, что с помощью этой методики можно проводить исследования клеточной стимуляции с использованием небольшого количества клеток, а также использовать небольшое количество реагентов. Наше исследование показало, что точная работа платформы с клетками и реагентами на микроуровне сводит к минимуму вариабельность от эксперимента к эксперименту. Платформа также очень универсальна.

Цифровой модуль микропотока может направлять клетки и реагенты в перфузионные камеры и из них с большой гибкостью, что позволяет быстро и легко настраивать и перенастраивать эксперименты. Для начала приготовьте стерильный раствор из 50 микрограммов на миллилитр фибронектина и с помощью многопортового шприцевого насоса втяните 30 микролитров раствора в каждый микрокапилляр, чтобы ускорить покрытие внутренних поверхностей микрокапилляров. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, затем извлеките и выбросьте раствор фибронектина и дайте микрокапиллярам высохнуть при комнатной температуре в течение шести часов.

Затем подсоедините микрокапилляры или перфузионные камеры с покрытием из волокна к поликарбонатной трубке, а трубку — к шприцевому насосу с помощью фитингов capite. В показанной здесь установке используется шприцевой насос с вспомогательным портом, поддерживающий шесть перфузионных камер. С помощью ленты закрепите корпус каждой перфузионной камеры на тепловом блоке и установите температуру тепловых блоков на 37 градусов Цельсия.

Затем погрузите открытые торцы перфузионных камер в резервуар, содержащий клетки, взвешенные в свежей поросли, среду равномерно диспергированную в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Дайте указание шприцевому насосу втянуть по 10 микролитров клеточной суспензии в каждую перфузионную камеру. Затем извлеките открытые концы перфузионных камер из суспензии ячеек и дайте указание шприцевому насосу набрать достаточно воздуха, чтобы переместить жидкие пробки в секции, закрепленные на тепловом блоке.

Позвольте клеткам прилипнуть к покрытым фибронектином внутренним поверхностям перфузионных камер, инкубируя их при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Тем временем перенесите открытые концы перфузионных камер в новый резервуар, содержащий свежую питательную среду. После периода адгезии дайте указание шприцевому насосу отправить жидкие пробки впустую, а затем втянуть 10 микролитров свежей среды в каждую камеру для пропитки, а затем достаточное количество воздуха, чтобы расположить свежую среду над прилипшими клетками.

Продолжайте инкубацию клеток при температуре 37 градусов Цельсия, меняя среду каждые два часа, пока культуры не станут достаточно сбалансированными и не расширятся. Рисунок. Нижняя пластина модуля DMF с 46 электродами из оксида индия и олова. Используя стандартные фотолитографические методы, нижняя пластина модуля DMF покрывается пятью микронами Lene C методом химического осаждения из газовой фазы, а затем покрывается 50 нанометрами тефлона af.

Затем прядильное покрытие и подложка из оксида индия и олова без рисунка с 50 нанометрами тефлона AF для использования в качестве верхней пластины. Используйте металлические компрессионные рамки для фиксации пластин в полимерной отливке с углублениями, которые поддерживают расстояние между пластинами 400 микрон. Такое расстояние в сочетании с размером приводного электрода 2,5 квадратного миллиметра определяет объем капель в 2,5 микролитра на электрод.

Затем вставьте трансферные микрокапилляры с тефлоновым покрытием в пространство между пластинами DMF. Расположите каждый из них так, чтобы он простирался до края родственного электрода привода до противоположного конца каждого переноса. Микрокапиллярное крепление капитным фитингом.

Затем зацепите электрические разъемы для подачи напряжения на электроды из оксида индия 10. Последовательности активации электродов автоматизированы с помощью управляемого компьютером электронного интерфейса, выполняющего заранее заданные сценарии. Затем заполните модули DMF на борту резервуаров соответствующими реагентами для стимуляции клеток, промывки и лизиса.

В некоторых случаях лучше всего загрузить сам стимул на более позднем этапе, непосредственно перед его использованием, взяв из загруженных встроенных резервуаров, распределить микрокапли на модуль DMF. Тестирование, активация микрокапель, включая их транспортировку между модулем DMF и передающими микрокапиллярами. Блейс. Сначала приготовьте стимул в свежей среде с 0,1%onic F1 27 в конечной концентрации 100 мкг на миллилитр.

Затем загрузите от 80 до 100 микролитров стимула в предназначенный для него бортовой резервуар. Затем извлеките открытые концы перфузионных камер из резервуара для среды и вставьте их в фитинги, прикрепленные к концам передаточных микрокапилляров, затем дайте команду шприцевому насосу отправить жидкие пробки из перфузионных камер в контейнер для отходов. Затем дайте команду модулю DMF сгенерировать 10 микролитровых капель стимула и доставить их в перфузионные камеры через передаточные микрокапилляры.

При необходимости инкубируйте клетки с помощью стимула при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-четырех часов. Замените на свежий стимул через равные промежутки времени после периода стимуляции. Дайте указание шприцевому насосу отправить стимул в контейнер для отходов и дайте команду модулю DMF подать каплю промывочного буфера объемом 10 микролитров в каждую перфузионную камеру.

Инкубируйте клетки с промывочным буфером в течение пяти минут. Затем замените промывочный буфер на 10 микролитров раствора лизиса и выдержите еще пять минут. Затем дайте команду шприцевому насосу отправить лизат каждой клетки в модуль DMF.

Снимите верхнюю пластину модуля DMF, стараясь не наклонять пластину вбок, так как это может привести к перекрестному загрязнению капель. Наконец, соберите лизаты из открытого модуля DMF с помощью пипетки для внеплатформенного анализа, такого как экспрессия генов, профилирование с помощью количественного R-T-P-C-R для подготовки платформы к следующему эксперименту. Сначала погружают переводные микрокапилляры, фитинги CAPITE и модульные пластины DMF в 10% отбеливатель на 10 минут при комнатной температуре, модульные пластины DMF промывают изопропанолом с последующей деионизацией воды и сушат с использованием газообразного азота, а затем запекают при 160 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Методы посева, описанные в этом протоколе, привели к адгезии примерно 500 макрофагов мирена на перфузионную камеру. После инкубации клеток с питательной средой при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов размер популяции удвоился и составил примерно 1000 клеток на перфузионную камеру. Здесь представлены результаты количественного анализа R-T-P-C-R четырех генов, которые, как известно, играют важную роль во врожденных иммунных реакциях на бактерии.

Макрофаги выращивали в обычных или микромасштабных культурах и стимулировали биочастицами кишечной палочки в течение одного или четырех часов. Синие столбцы указывают на среднее увеличение экспрессии генов при стимуляции традиционно культивируемых клеток, в то время как красные столбцы указывают на индуцированную экспрессию в клетках, выращенных и стимулированных. В микромасштабных культурах полосы погрешностей указывают на стандартные отклонения между биологическими репликациями из трех независимых экспериментов.

Результаты профилирования экспрессии генов были очень похожими, несмотря на то, что в традиционных культурах использовались 96-луночные планшеты с примерно 50 000 клеток в лунке, в то время как в микромасштабных культурах использовались микрокапилляры с примерно 1000 клеток на перфузионную камеру. Снижение расхода элементов в пять раз и снижение расхода реагентов в 3-50 раз. Относительно обычных экспериментов.

Метод может быть использован для культивирования практически любого типа адгезивных клеток, в некоторых случаях с использованием другого компонента внеклеточного матрикса или роста. Средние типы клеток с неадгезией могут быть сложными, но стратегии клеточного привязки оказались успешными в аналогичных условиях. Описанный здесь подход поддерживает микромасштабное культивирование в течение 24 часов.

Платформа также включает в себя все функции для проведения долгосрочного культивирования, но необходимо разработать протокол пассирования клеток. Дополнительные модули могут быть интегрированы в цифровой микрофлюидный куб с помощью микрокапиллярных межсоединений. Таким образом, DMF служит центральным узлом для подключения периферийных модулей для выполнения сложных рабочих процессов.

В первую очередь мы сосредоточились на характеристике транскрипционных реакций хозяина на инфекционные агенты, но платформа разработана как чрезвычайно универсальная, поэтому она должна поддерживать широкий спектр исследовательских приложений.