Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток

Общая цель данной процедуры заключается в сборке и использовании полуавтоматизированной микрофлюидной платформы для культивирования и стимуляции небольших популяций клеток, а также получения клеточных лизатов для молекулярного анализа. Это достигается путем первоначального создания микромасштабных клеточных культур в микрокапиллярах с фибронектиновым покрытием, которые называют камерами перфузии клеток. На втором этапе камеры перфузии подключаются к модулю цифровой микрофлюики (DMF), который обеспечивает гибкий способ подачи реагентов к микромасштабным клеточным культурам и их отвода от них.

Затем модуль DMF подает интересующий стимул в перфузионные камеры, и клетки инкубируются со стимулом в течение заданного времени воздействия. В завершение клетки лизируют химическим способом, и лизаты собирают на модуле DMF для молекулярного анализа. Затем полученные лизаты анализируют с помощью количественной R-T-P-C-R, чтобы охарактеризовать транскрипционный ответ популяции клеток на стимул.

Основным преимуществом этого метода перед традиционными способами культивирования клеток является возможность проведения исследований по стимуляции клеток с использованием их малого количества, а также малых объемов реагентов. Наши исследования показали, что прецизионное манипулирование клетками и реагентами на микромасштабном уровне в рамках данной платформы минимизирует вариативность между экспериментами. Кроме того, платформа обладает высокой универсальностью.

Модуль цифрового микропотока позволяет направлять клетки и реагенты в перфузионные камеры и из них с большой гибкостью, что обеспечивает возможность быстрой и легкой настройки и реконфигурации экспериментов. Для начала приготовьте стерильный раствор фибронектина в концентрации 50 µg/mL и с помощью многопортового шприцевого насоса введите по 30 µL раствора в каждый микрокапилляр для ускорения покрытия внутренних поверхностей микрокапилляров. Инкубируйте при 37 °C в течение двух часов, затем удалите и утилизируйте раствор фибронектина и дайте микрокапиллярам высохнуть при комнатной температуре в течение шести часов.

Затем подсоедините микрокапилляры с покрытием из нитинола или перфузионные камеры к поликарбонатной трубке, а трубку — к шприцевому насосу с помощью капиллярных фитингов. В данной установке используется шприцевой насос с многоканальным портом, поддерживающий шесть перфузионных камер. С помощью ленты закрепите корпус каждой перфузионной камеры на термоблоке и установите температуру термоблока на 37 °C.

Затем погрузите открытые концы перфузионных камер в резервуар с клетками, суспендированными в свежей ростовой среде с равномерным распределением при концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. С помощью шприцевого насоса введите по 10 µL клеточной суспензии в каждую перфузионную камеру. Затем извлеките открытые концы перфузионных камер из клеточной суспензии и с помощью шприцевого насоса втяните объем воздуха, достаточный для перемещения жидкостных пробок в секции, закрепленные на термоблоке.

Позвольте клеткам прикрепиться к внутренним поверхностям перфузионных камер, покрытым фибронектином, инкубируя их при 37 °C в течение одного-двух часов. Тем временем перенесите открытые концы перфузионных камер в новый резервуар со свежей ростовой средой. После завершения периода адгезии настройте шприцевой насос так, чтобы жидкие пробки были сброшены в отходы, затем введите по 10 µL свежей среды в каждую перфузионную камеру, после чего введите достаточное количество воздуха, чтобы переместить свежую среду к прикрепившимся клеткам.

Продолжайте инкубировать клетки при 37 °C, заменяя среду каждые два часа до тех пор, пока культуры не уравновесятся и не расширятся в достаточном объеме. Схема. Нижняя пластина модуля DMF с 46 электродами из оксида индия-олова. С помощью стандартных методов фотолитографии нанесите на нижнюю пластину модуля DMF слой Lene C толщиной 5 µm методом химического осаждения из газовой фазы, а затем нанесите методом центрифугирования слой Teflon af толщиной 50 nm.

Затем нанесите методом центрифугирования слой Teflon AF толщиной 50 nanometers на неструктурированную стеклянную подложку с оксидом индия-олова, которая будет использоваться в качестве верхней пластины. Используйте металлические компрессионные рамки для фиксации пластин в полимерном корпусе с выемками, которые обеспечивают зазор 400 micron между пластинами. Данный зазор в сочетании с размером рабочего электрода 2.5 millimeters squared определяет объем капли как 2.5 microliters на электрод.

Затем вставьте микрокапилляры для переноса с тефлоновым покрытием в пространство между пластинами DMF. Расположите каждый капилляр таким образом, чтобы один его конец доходил до края соответствующего приводного электрода, а на противоположном конце каждого микрокапилляра для переноса закрепите соединительный наконечник.

Затем подключите электрические разъемы для подачи напряжения на оксидные электроды из оксида индия (Indium 10). Последовательности активации электродов автоматизированы с помощью управляемого компьютером электронного интерфейса, выполняющего предварительно заданные скрипты. Затем заполните бортовые резервуары модулей DMF соответствующими реагентами для стимуляции, промывки и лизиса клеток.

В некоторых случаях целесообразно загружать сам стимул на более позднем этапе, непосредственно перед использованием, используя загруженные бортовые резервуары; затем дозируйте микрокапли на модуль DMF. Проверьте активацию микрокапель, включая их перемещение между модулем DMF и переносящими микрокапиллярами Блайса. Сначала подготовьте стимул в свежей среде с 0,1% onic F1 27 до конечной концентрации 100 µg/mL.

Затем загрузите от 80 до 100 µL стимула в соответствующий встроенный резервуар. Далее извлеките открытые концы перфузионных камер из резервуара с питательной средой и вставьте их в капиллярные фитинги, закрепленные на концах переносящих микрокапилляров, после чего запрограммируйте шприцевой насос на перемещение жидкостных пробок из перфузионных камер в контейнер для отходов. Затем настройте модуль DMF на генерацию капель стимула объемом 10 µL и их подачу в перфузионные камеры через переносящие микрокапилляры.

При необходимости инкубируйте клетки со стимулом при 37 °C от одного до четырех часов. По завершении периода стимуляции регулярно заменяйте стимул на свежий. Настройте шприцевой насос на слив стимула в контейнер для отходов, а модуль DMF — на подачу капли промывочного буфера объемом 10 µL в каждую перфузионную камеру.

Инкубируйте клетки в промывочном буфере в течение пяти минут. Затем замените промывочный буфер на 10 µL раствора для лизиса и инкубируйте еще пять минут. Далее настройте шприцевой насос так, чтобы каждый лизат клеток направлялся в модуль DMF.

Снимите верхнюю пластину модуля DMF, стараясь не наклонять её в стороны, так как это может привести к перекрестному загрязнению капель. В завершение соберите лизаты из открытого модуля DMF с помощью дозатора для проведения внеплатформенного анализа, такого как экспрессия генов или профилирование с помощью количественной R-T-P-C-R, чтобы подготовить платформу к следующему эксперименту. Сначала погрузите переносящие микрокапилляры, фитинги CAPITE и пластины модуля DMF в 10% раствор гипохлорита натрия на 10 минут при комнатной температуре, затем промойте пластины модуля DMF изопропанолом, после чего деионизированной водой, высушите потоком азота и прокаливайте при 160 °C в течение 10 минут.

Методы посева, описанные в данном протоколе, обеспечили прикрепление примерно 500 макрофагов miren на одну перфузионную камеру. После инкубации клеток в ростовой среде при 37 °C в течение 16 часов размер популяции увеличился вдвое и составил примерно 1000 клеток на перфузионную камеру. Здесь представлены результаты количественного анализа R-T-P-C-R четырех генов, которые, как известно, играют важную роль в реакциях врожденного иммунного ответа на бактерии.

Макрофаги выращивали в традиционных или микромасштабных культурах и стимулировали биочастицами e coli в течение одного или четырех часов. Синие столбцы показывают среднее кратное увеличение экспрессии генов при стимуляции клеток, выращенных традиционным способом, тогда как красные столбцы указывают на индуцированную экспрессию в выращенных и стимулированных клетках. Для микромасштабных культур планки погрешностей обозначают стандартные отклонения между биологическими повторами в трех независимых экспериментах.

Результаты профилирования экспрессии генов были очень схожими, несмотря на то, что в традиционных культурах использовались 96-луночные планшеты с примерно 50 000 клеток на лунку, тогда как в микромасштабных культурах использовались микрокапилляры с примерно 1000 клетками на одну перфузионную камеру. Вариабельность от эксперимента к эксперименту была как минимум сопоставимой, а зачастую и ниже в микромасштабных культурах, о чем свидетельствуют более короткие планки погрешностей при работе в микромасштабе. Потребление клеток сократилось в пять раз, а потребление реагентов — от 3 до 50 раз по сравнению с традиционными экспериментами.

Данный метод может быть использован для культивирования практически любого типа адгезивных клеток, в некоторых случаях с применением другого компонента внеклеточного матрикса или среды для роста. Культирование неадгезивных типов клеток может быть затруднительным, однако стратегии привязки клеток доказали свою эффективность в аналогичных условиях. Описанный здесь подход позволяет осуществлять культивирование в микромасштабе в течение периода до 24 часов.

Платформа включает в себя все функции, необходимые также для длительного культивирования, однако необходимо разработать протокол пассирования клеток. Дополнительные модули могут быть интегрированы в цифровой микрофлюидный куб через микрокапиллярные межсоединения. Таким образом, DMF служит центральным узлом для подключения периферийных модулей с целью реализации сложных рабочих процессов.

В основном мы сосредоточились на характеристике транскрипционных ответов хозяина на инфекционные агенты, однако платформа разработана как универсальная, поэтому она должна поддерживать широкий спектр исследовательских задач.