Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Общая цель данного протокола — продемонстрировать процесс изготовления и работу микрофлюидного чипа, который позволяет с высокой эффективностью изолировать и культивировать отдельные клетки. Этот метод представляет собой полезный инструмент для любой области, где требуется изоляция и культивирование единичных клеток. Основным преимуществом данной методики является высокая эффективность загрузки одиночных клеток в большие массивы микролунок.

Кроме того, для работы устройства используются только мягкий поток и сила тяжести, что минимизирует повреждение клеток. Данный метод может быть применен для окончательной диагностики таких заболеваний человека, как рак, при которых клеточная гетерогенность влияет на ответ клеток. Мы задумали разработать этот метод в процессе создания микролуночных клеточных линий, поскольку метод предельного разведения был крайне трудоемким и неэффективным. Теперь данный метод позволяет проводить анализ отдельных клеток.

Этот метод также может быть применен в других целях, таких как создание условий и долгосрочное наблюдение за ходом развития и поведением отдельных клеток. Для начала изготовьте силанизированные мастер-формы как для слоя изоляции одиночных клеток, так и для слоя микролуночной культуры, используя стандартную фотолитографию, описанную в сопровождающем текстовом протоколе. Для каждой мастер-формы смешайте 16 г основы PDMS с 1,6 г отвердителя в одноразовом стакане и перемешивайте смесь до однородности.

Затем поместите основные формы в чашки Петри диаметром 150 мм и залейте формы PDMS. Поместите чашки Петри в эксикатор и создайте вакуум на один час, чтобы удалить пузырьки воздуха из PDMS. По истечении одного часа извлеките чашки из эксикатора и поместите их в обычную печь при температуре 65 °C на три-шесть часов для отверждения PDMS.

Затем извлеките планшеты из печи и дайте им остыть до комнатной температуры. После охлаждения отделите отвержденный массив захватывающих лунок из PDMS и массив микролунок для культивирования от мастер-форм и вырежьте устройства с помощью лезвия бритвы. Затем с помощью просекателя диаметром 0,75 мм проделайте по одному отверстию на каждом конце микроканала в слое массива захватывающих лунок.

Используйте клейкую ленту для очистки поверхности, которая станет внутренней поверхностью устройства, затем поместите отдельные слои внутренней стороной вверх в установку для плазменной очистки для кратковременной обработки кислородной плазмой. По завершении извлеките слои PDMS из установки и с помощью стереомикроскопа совместите и соедините верхний и нижний слои устройства. Поместите совмещенное устройство в печь при температуре 65 °C на 24 часа для создания прочной связи между слоями PDMS.

Затем поместите склеенное устройство из PDMS в деионизированную воду и поместите контейнер в эксикатор под вакуум на 15 минут, чтобы удалить воздух из микроканала устройства. После полного удаления воздуха из устройства поместите его в ламинарный шкаф для культивирования тканей и используйте УФ-излучение для стерилизации поверхности устройства в течение 30 минут. Затем замените деионизированную воду в устройстве на 5% раствор бычьего сывороточного альбумина в PBS и инкубируйте устройство при 37 °C в течение 30 минут.

Это позволит заблокировать поверхность и повысить эффективность переноса изолированных клеток из захватных лунок в культуральные лунки. Через 30 минут замените блокирующий раствор в устройстве стерильным PBS. Приготовьте суспензию единичных клеток с концентрацией 2,5 миллиона клеток на миллилитр и наберите в пипетку 50 µL суспензии.

Затем перенесите клетки в устройство через выходное отверстие. Загрузите еще 50 µL клеточной суспензии и введите ее в устройство через входное отверстие, чтобы равномерно заполнить весь микроканал клетками. После загрузки используйте стерильную пробку из нейлоновой рыболовной лески диаметром один миллиметр, чтобы герметично закрыть выходное отверстие устройства.

Затем наполните стерильный шприц объемом 1 мл культуральной средой, удалите все остатки пузырьков воздуха и установите его в шприцевой насос. Присоедините к шприцу тупоконечную иглу 23G и с помощью трубки из политетрафторэтилена соедините иглу с входным отверстием устройства. После подключения трубки извлеките пробку из выходного отверстия и подождите две минуты, пока клетки под действием силы тяжести осядут в лунки для захвата одиночных клеток.

Затем установите скорость подачи шприцевого насоса на 600 µL в минуту. Снимите заглушку выходного отверстия и в течение 30 секунд вымойте незахваченные клетки. Подождите две минуты до стабилизации давления.

Затем извлеките трубку из входного отверстия устройства и закройте заглушками и входное, и выходное отверстия, чтобы создать закрытую систему культивирования. Теперь вручную переверните устройство, чтобы перенести захваченные единичные клетки в культуральные микролунки на противоположной стороне устройства. Затем поместите устройство в 100-миллиметровую чашку для культивирования тканей, добавьте 10 мл стерильного PBS вокруг устройства и поместите чашку в инкубатор.

Для замены культуральной среды сначала нанесите две капли среды на поверхность устройства из ПДМС рядом с входом и выходом, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в микроканал. Затем с помощью биопсийного панча диаметром 0,75 мм проделайте два отверстия в верхней части устройства из ПДМС рядом с концами микроканала. Убедитесь, что прокол сделан только через верхний слой устройства.

Затем наполните пластиковый шприц объемом 1 мл свежей предварительно прогретой средой и с помощью тупоконечной иглы 23G и трубки из ПТФЭ подсоедините его к созданному входному порту. Медленно введите около 120 мкл свежей среды в устройство в течение пяти минут, чтобы заменить старую среду. По завершении герметично закройте входной и выходной порты двумя пробками и верните устройство в инкубатор для культур клеток.

Количество клеток, попадающих в лунки для захвата, варьирует примерно от 68% до 85% в зависимости от типа клеток. Кроме того, для всех трех типов клеток в большинстве лунок для захвата содержится только одна клетка. После переноса захваченных клеток KT98 в культуральные лунки примерно в 77% лунок находилась только одна клетка, в 16% — клеток не было, в 6% — две клетки, и менее чем в 1% лунок находилось три или более клеток.

В течение семи дней изолированные одиночные клетки демонстрировали гетерогенные паттерны роста. В то время как некоторые клетки размножались, другие этого не делали. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за 20 минут при условии правильного ее проведения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как использовать эту платформу для высокопроизводительной изоляции единичных клеток и эндокринного культивирования для повышения эффективности ваших экспериментов с единичными клетками. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости избегать попадания пузырьков воздуха в микроканал и предотвращать агрегацию клеток с течением времени.