Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Общая цель этого протокола — продемонстрировать изготовление и работу микрофлюидного чипа, который позволяет проводить высокоэффективную изоляцию и культивирование одиночных клеток. Этот метод является полезным инструментом для любой области, которая может извлечь выгоду из выделения и культивирования одиночных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает высокой эффективностью при загрузке одиночных ячеек в большие массивы микролунок.

Кроме того, для работы устройства используется только мягкий поток и гравитационная сила, что сводит к минимуму повреждение клеток. Применение этого метода направлено на конечную диагностику заболеваний человека, таких как рак, при котором клеточная гетерогенность влияет на реакцию клетки, поэтому у нас возникла идея разработки этого метода, когда мы создавали клеточную линию микролунок, потому что метод предельного разведения был очень трудоемким и неэффективным. Теперь этот метод может дать представление об анализе отдельных клеток.

Он также может быть применен к другим приложениям, таким как установление и своевременность наблюдения за индивидуальным ходом и поведением клеток. Для начала изготовьте силанизированные мастер-формы как для слоя изоляции отдельных клеток, так и для слоя микролунок с использованием стандартной фотолитографии, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Для каждой мастер-формы соедините в одноразовом стаканчике 16 граммов основы PDMS с 1,6 граммами отвердителя и перемешайте смеси до однородности.

Затем поместите мастер-формы в 150-миллиметровые чашки Петри и залейте PDMS поверх форм. Поместите чашки Петри в эксикатор и примените вакуум на один час, чтобы удалить пузырьки воздуха из PDMS. Через час выньте посуду из эксикатора и поместите ее в обычную духовку при температуре 65 градусов Цельсия на три-шесть часов, чтобы вылечить PDMS.

Затем достаньте посуду из духовки и дайте ей остыть до комнатной температуры. После остывания очистите отвержденный массив захватных лунок PDMS и массив микролунок для культивирования из мастер-форм и вырежьте устройства с помощью лезвия бритвы. Затем с помощью перфоратора диаметром 0,75 мм создайте по одному отверстию на каждом конце микроканала на слое массива скважин захвата.

Используйте ленту для очистки того, что станет внутренней поверхностью устройства, а затем поместите отдельные слои внутренними поверхностями вверх в плазменный очиститель для кратковременной обработки кислородной плазмой. Когда закончите, удалите слои PDMS из очистителя плазмы и с помощью стереомикроскопа выровняйте и соедините верхний и нижний слои устройства. Поместите выровненное устройство в духовку при температуре 65 градусов Цельсия на 24 часа, чтобы создать прочное сцепление между слоями PDMS.

Далее поместите скрепленное устройство PDMS в деионизированную воду и поместите контейнер в эксикатор под вакуум на 15 минут, чтобы удалить воздух из микроканала устройства. Теперь, когда весь воздух удален из устройства, поместите устройство PDMS в колпак для культуры тканей и используйте ультрафиолетовый свет для стерилизации поверхности устройства в течение 30 минут. Затем замените деионизированную воду в устройстве на 5% бычьего сывороточного альбумина в PBS и инкубируйте устройство при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Это позволит блокировать поверхность и повысить эффективность переноса изолированных клеток из лунок захвата в лунки для культивирования. Через 30 минут замените блокирующий раствор в приборе на стерильный PBS. Приготовьте одноклеточную суспензию с концентрацией 2,5 миллиона клеток на миллилитр и загрузите в пипетку 50 микролитров суспензии.

Затем перенесите ячейки в устройство через выходное отверстие устройства. Загрузите еще 50 микролитров клеточной суспензии и перенесите ее в устройство через входное отверстие, чтобы равномерно заполнить весь микроканал ячейками. После загрузки используйте стерильную заглушку, изготовленную из нейлоновой лески диаметром один миллиметр, чтобы запечатать выходное отверстие устройства.

Затем наполните стерильный шприц объемом один миллилитр питательной средой, удалите все остаточные пузырьки воздуха и установите его в шприцевой насос. Подсоедините тупую иглу 23 калибра к шприцу и с помощью политетрафторэтиленовой трубки подсоедините иглу к входному отверстию устройства. После подключения трубки выньте пробку из выпускного отверстия и подождите две минуты, пока ячейки осядут в одиночные ячейки под действием гравитационной силы.

Далее установите шприцевую помпу на 600 микролитров в минуту. Снимите пробку розетки и промойте незахваченные элементы в течение 30 секунд. Подождите две минуты, чтобы давление стабилизировалось.

Затем извлеките трубку из входного отверстия устройства и запечатайте входное и выходное отверстия заглушками, чтобы образовалась закрытая система культивирования. Теперь переверните устройство рукой, чтобы перенести захваченные одиночные клетки в микролунки для культур с другой стороны устройства. Затем поместите устройство в 100-миллиметровую чашку для культуры тканей, добавьте 10 миллилитров стерилизованного PBS вокруг устройства и поместите чашку в инкубатор.

Чтобы заменить питательную среду, сначала поместите две капли питательной среды на верхнюю часть устройства PDMS рядом с входом и выходом, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в микроканал. Затем с помощью 0,75-миллиметрового перфоратора для биопсии проделайте два отверстия в верхней части устройства PDMS рядом с концами микроканала. Обязательно пробивайте только верхний слой устройства.

Затем наполните одномиллилитровый пластиковый шприц, содержащий свежую предварительно подогретую среду, и используйте тупую иглу 23 калибра и трубку из ПТФЭ, чтобы подсоединить его к вновь созданному входному порту. Медленно влейте примерно 120 микролитров свежей среды в устройство в течение пяти минут, чтобы заменить старую среду. По завершении загерметизируйте входной и выходной порты с помощью двух заглушек и верните устройство в инкубатор для клеточных культур.

Количество клеток, которые попадают в захватывающие лунки, колеблется от 68% до 85% в зависимости от типа ячейки. Кроме того, большинство захватывающих лунок содержат только одну ячейку для всех трех типов ячеек. После переноса захваченных клеток KT98 в культуральные лунки около 77% лунок имели только одну клетку, 16% не имели клеток, 6% имели две клетки и менее 1% лунок имели три или более клеток.

В течение семи дней изолированные одиночные клетки демонстрировали гетерогенные модели роста. В то время как некоторые клетки размножались, другие – нет. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 20 минут, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать эту высокопроизводительную платформу для выделения эндокринных культур для выделения отдельных клеток для повышения производительности ваших экспериментов с одиночными клетками. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что пузырьки воздуха не должны попадать в микроканал и не допускать скопления клеток с течением времени.