Мониторинг Cell-автономных циркадные ритмы часы экспрессии гена люциферазы Использование Репортеры Биолюминесценция

В этом протоколе подробно описывается генерация люциферазных репортерных клеточных линий и последующий мониторинг клеточных автономных циркадных ритмов экспрессии биолюминесценции. Сначала конструируют лентивирусные репортеры экспрессии люциферазы и производят лентивирусные частицы, продолжают инфицировать интересующие клетки и амплифицируют выбранные культуры. Затем контролируйте экспрессию биолюминесценции в синхронизированных репортерных клетках с помощью соответствующего записывающего устройства.

В конечном счете, биолюминесцентная запись используется для демонстрации клеточных автономных циркадных ритмов. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как транзиторная трансфекция и защита зародышевой линии, заключается в том, что ВИР является опосредованным. Ген обеспечивает стабильную интеграцию в геном клеток, а также большую эффективность и универсальность.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования часов. Например, существуют ли циркадные часы, специфичные для тканей? Если да, то каковы свойства тканеспецифичных циркадных часов?

Хотя этот метод может дать представление о механизмах часов. Он также может быть применен к другим системам, таким как динамика клеточного цикла, опухолегенез и так далее. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы решили изучить специфические для тканей или клеток часы безопасности.

Демонстрировать процедуру будут доктор Чита Норм Напкин, научный сотрудник с постдоком, и Сандра, аспирантка из моей лаборатории Atory. Как правило, циркадная репортерная конструкция млекопитающих содержит экспрессионную кассету, в которой циркадный промотор слит с геном люциферазы. У этого лентивирусного репортера дестабилизированная люцифераза находится под контролем мыши в отношении двух промоторов.

Подробные инструкции по построению репортерных векторов с помощью рекомбинационной реакции см. в сопроводительной рукописи для эффективной трансфекции. Начните с культивирования эмбриональных клеток почек человека с низким числом пассажей, которые на 90-100% сливаются. Теперь покрыть шесть, хорошо засеять пластины.

Для трансфекции добавьте в каждую по одному миллилитру 0,001% поли-ллицина, хорошо выдержите при комнатной температуре 20 минут и промойте один раз PBS. Затем соберите клетки с помощью трипсина и засейте клетки в каждую лунку предварительно покрытых пластин. Закручивайте пластины для получения равномерного распределения ячеек.

Убедитесь, что засеянные клетки достигли конфлюенции от 80 до 90% в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров. Приготовьте плазмидную смесь для трансфекции лентивирусной репортерной плазмиды, ДНК и трех упаковочных векторов в качестве контроля как для трансфекции, так и для последующей инфекции. Включите дополнительную лунку для лентивирусного вектора экспрессии GFP, который содержит усиленный зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора ЦМВ.

Далее добавьте в плазмиды 100 микролитров 0,25 молярного хлорида кальция и тщательно перемешайте. Затем добавьте 100 микролитров двух растворов XBBS и аккуратно перемешайте. Инкубируйте смесь ДНК при комнатной температуре в течение 15 минут.

Во время ожидания замените среду из 2 9 3 Т-клеток на два миллилитра свежей среды. Верните планшет в инкубатор минимум на 10 минут для выравнивания рН среды. Затем по каплям добавьте в клетки трансфекционную смесь, осторожно покрутите планшет, понаблюдайте за образованием частиц под микроскопом, а затем поместите клетки в инкубатор на ночь.

Примерно через 16 часов после трансфекции пополните среду двумя миллилитрами свежего DMEM и культурой на ночь. Затем для оценки эффективности трансфекции оцените экспрессию EGFP в контрольных клетках трансфекции. Эффективность трансфекции от 90 до 100% с высокой экспрессией EGFP является надежным предиктором хорошей вирусной подготовки.

Соберите среду, содержащую секретируемые инфекционные вирусные частицы, центрифугой для удаления остаточных 2, 9, 3 Т-клеток и сбора вируссодержащего суперната. На третий день засейте примерно 12 003 Т-три клетки на 12-луночной культуре в течение ночи до 20-30% плавности и наблюдайте за клетками на четвертый день. Еще на четвертый день добавьте полимозг в собранную среду, содержащую вирусные частицы, и хорошо перемешайте пипетированием.

Теперь отсадите среду из трех Т-трех клеток и добавьте по одному миллилитру вирусной смеси на лунку. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи после однократной промывки клеток PBS, пополните среду и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи для восстановления и роста. При слиянии клетки и культура расщепляются в течение ночи на следующий день.

Чтобы приступить к отбору инфицированных клеток, добавьте свежую среду, содержащую 10 мкг на миллилитр. Если отбросить взрывную кислоту, то взрывная кислота в машине для убийства должна быть определена эмпирически для каждой клеточной линии. Пополняйте запасы среды, содержащей бластин, каждые два-три дня для непрерывного отбора устойчивых к антибиотикам клеток.

Выражение часов репортеров. После размножения культуры устойчивых к бластину репортерных клеток в 35-миллиметровые чашки для культивирования до слияния, мы обычно готовим три или более чашки для каждой линии репортерных клеток при каждом условии для сарсистого фенотипа. После одной промывки PBS добавьте DMEM, содержащий 10 микромоляров форлина, или 200 наномолярный дексаметазон, инкубированный при 37 градусах Цельсия в течение одного часа для синхронизации клеток.

Теперь поместите клетки в свежеприготовленный носитель информации. Накройте чашки для культивирования 40-миллиметровыми стерильными крышками и запечатайте вакуумной смазкой для предотвращения испарения. Загрузите посуду на люминометр люминометра и запустите биолюминесценцию в реальном времени.

Запись Для записи 96 старой пластины. С помощью двух записывающих устройств GSR см. рукопись аккомпанемента. Мы легко записываем ритм в течение пяти-семи дней в программе анализа поясничного цикла.

Первый базовый уровень соответствовал исходным данным. Затем используйте исходные вычтенные данные, чтобы подогнать их под синусоиду и определить необходимые параметры для сэмплов, которые демонстрируют устойчивые ритмы. Качество данных о подъеме ног более 90% легко достигается благодаря высокому переходному Luminate.

Чувствуйте изменения вверх и средне. Обычно мы исключаем первый цикл данных из нашего анализа для представления данных. При необходимости стройте графики необработанных данных в зависимости от времени.

Построение графика исходных вычитаемых данных для сравнения амплитуды и фазы как при транзиторной трансфекции 2, 9, 3 Т-клеток, так и при инфицировании клеточных линий. Флуоресцентные изображения трансфицированных и трансдуцированных клеток, экспрессирующих GFP, указывают на высокую эффективность лентивирусной системы доставки генов. Основная петля обратной связи циркадных часов состоит из транскрипционных факторов, которые воздействуют на элементы циркадного энхансера, вызывая ритмичную экспрессию генов.

Здесь четыре различные репортерные конструкции в трех Т-трех клетках производят различные фазы экспрессии репортера. Новые промежуточные фазы могут быть сгенерированы с помощью комбинаторной регуляции несколькими циркадными элементами с использованием нокдауна генов через РНК-интерференцию и фармакологически активные соединения. В этом эксперименте использовался люминометр люмминесцентного цикла для биолюминесцентной регистрации клеток в 35-миллиметровых чашках в клетках U2 OS.

Ирнка была использована для освещения нокдаун-эффектов генов Cry One и Cry two. Здесь для биолюминесцентной регистрации клеток был использован синергетический люминометр. В 96-луночном планшете в три Т три репортерные ячейки.

РНК были использованы для оценки влияния триединого нокдауна на клеточные ритмы. В данном примере для биолюминесцентной регистрации клеток в 384 году была использована система UX и люминометр Tecan. В то время как планшеты выбраны в соответствии с указаниями, малые молекулы могут фармакологически нацеливаться и нарушать функцию белка в клеточных ритмах репортерных клеток U2 OS.

После его разработки. Этот метод проложил путь к исследованиям в области циркадной биологии, чтобы изучить часовые механизмы и физиологию в различных типах клеток и тканей. После просмотра этого видео у него должно быть хорошее понимание того, как генерировать Люцифера, сообщать о клеточных линиях и следить за объемами.

И не забывайте, что работа с ВИР может быть чрезвычайно опасной для заказов, и предвестники, такие как средства индивидуальной защиты и обеззараживания вирусов, всегда должны быть приняты во время выполнения этой процедуры.