Мониторинг Cell-автономных циркадные ритмы часы экспрессии гена люциферазы Использование Репортеры Биолюминесценция

В данном протоколе подробно описывается процесс создания клеточных линий с люциферазным репортером и последующий мониторинг клеточных автономных циркадных ритмов экспрессии биолюминесценции. Сначала создаются лентивирусные репортеры экспрессии люциферазы и производится получение лентивирусных частиц, после чего проводится заражение целевых клеток и амплификация отобранных культур. Затем осуществляется мониторинг экспрессии биолюминесценции в синхронизированных репортерных клетках с использованием подходящего регистрирующего устройства.

В конечном итоге регистрация биолюминесценции используется для демонстрации автономных циркадных ритмов клеток. Основным преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как транзиторная трансфекция и защита зародышевой линии, является то, что VIR обеспечивает стабильную интеграцию гена в геном клеток, а также более высокую эффективность и универсальность.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования циркадных часов. Например, существуют ли тканеспецифичные циркадные часы? Если да, то каковы свойства тканеспецифичных циркадных часов?

Хотя данный метод позволяет получить представление о механизмах работы биологических часов, его также можно применять к другим системам, таким как динамика клеточного цикла, турморогенез и так далее. Идея этого метода возникла у нас, когда мы решили изучить циркадные часы, специфичные для определенных тканей или типов клеток.

Процедуру продемонстрируют доктор Чита Норм Напкин, постдок, и Сандра, аспирантка из моей лаборатории Atory. Как правило, mammalian circadian reporter construct содержит экспрессионную кассету, в которой циркадный промотор слит с геном люциферазы. В данном лентивирусном репортере дестабилизированная люцифераза находится под контролем мышиного промотора per2.

Для получения подробных инструкций по конструированию репортерных векторов с помощью реакции рекомбинации обратитесь к сопроводительной статье для обеспечения эффективной трансфекции. Начните с культуры клеток эмбриональной почки человека с низким числом пассажей, достигших 90–100% конфлюэнтности. Теперь подготовим шестилуночные планшеты для культивирования.

Для трансфекции добавьте в каждую лунку один миллилитр 0,001% поли-L-лизина, инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут и один раз промойте PBS. Затем соберите клетки с помощью трипсина и засейте их в каждую лунку предварительно покрытых планшетов. Вращайте планшеты круговыми движениями для равномерного распределения клеток.

Убедитесь, что высеянные клетки достигли конфлюэнтности 80–90% в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Приготовьте смесь для трансфекции плазмид, состоящую из лентивирусной репортерной плазмиды, ДНК и трех упаковочных векторов, в качестве контроля как для трансфекции, так и для последующего заражения. Добавьте дополнительную лунку для лентивирусного вектора экспрессии GFP, содержащего усиленный зеленый флуоресцентный белок под контролем промотора CMV.

Затем добавьте к плазмидам 100 µL 0,25 M хлорида кальция и тщательно перемешайте. После этого добавьте 100 µL раствора 2X BBS и аккуратно, но тщательно перемешайте. Инкубируйте смесь ДНК при комнатной температуре в течение 15 минут.

Пока вы ждете, замените среду в клетках 2 9 3 T двумя миллилитрами свежей среды. Верните планшет в инкубатор минимум на 10 минут для уравновешивания pH среды. Затем по каплям добавьте смесь для трансфекции к клеткам, осторожно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями, проверьте образование частиц под микроскопом и поместите клетки в инкубатор на ночь.

Примерно через 16 часов после трансфекции замените среду, добавив два миллилитра свежего DMEM, и культивируйте клетки в течение ночи. Затем, для оценки эффективности трансфекции, проанализируйте экспрессию EGFP в контрольных клетках. Эффективность трансфекции от 90 до 100% с высоким уровнем экспрессии EGFP является надежным предиктором качественной подготовки вирусного препарата.

Соберите среду, содержащую секретируемые инфекционные вирусные частицы, и центрифугируйте её, чтобы удалить остатки клеток 2 9 3 T, после чего соберите супернатант, содержащий вирус. На третий день высейте примерно 12, 003 T трех клеток в 12-луночный планшет, культивируйте их в течение ночи до достижения 20–30% конфлюэнтности и осмотрите клетки на четвертый день. Также на четвертый день добавьте полибрейн в собранную среду с вирусными частицами и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.

Теперь аспирируйте среду из трех лунок с клетками T3 и добавьте по одному миллилитру вирусной смеси в каждую лунку. Инкубируйте при 37 °C в течение ночи; после однократного промывания клеток PBS замените среду и инкубируйте клетки при 37 °C в течение ночи для восстановления и роста. После достижения конфлюэнтности проведите пассирование клеток и культивируйте их в течение ночи до следующего дня.

Для начала селекции инфицированных клеток добавьте свежую среду, содержащую 10 µg/mL бластоцидина. Концентрация бластоцидина, необходимая для гибели клеток, должна быть определена эмпирически для каждой клеточной линии. Обновляйте среду, содержащую бластоцидин, каждые два-три дня для непрерывной селекции антибиотикорезистентных клеток.

Экспрессия репортеров циркадных ритмов. После пересева культуры репортерных клеток, устойчивых к бластицину, в чашки Петри диаметром 35 мм до достижения конфлюэнтности, для анализа фенотипа обычно готовят три или более чашек для каждой линии репортерных клеток при каждом условии. После одного промывания с помощью PBS добавляют DMEM, содержащий 10 µM форлина или 200 nM дексаметазона, и инкубируют при 37 °C в течение одного часа для синхронизации клеток.

Теперь перенесите клетки в свежеприготовленную регистрирующую среду. Накройте чашки с культурой стерильными покровными стеклами диаметром 40 мм и герметизируйте их вакуумной смазкой для предотвращения испарения. Установите чашки в люминометр Luminous Cycle и запустите регистрацию биолюминесценции в режиме реального времени.

Регистрация. Для регистрации данных с 96-луночного планшета с использованием двух устройств регистрации GSR см. сопровождающую рукопись. Мы с легкостью регистрировали ритм в течение пяти-семи дней с помощью программы для анализа циклов Lum.

Сначала выполните аппроксимацию базовой линии для необработанных данных. Затем используйте данные после вычитания базовой линии для аппроксимации синусоидой и определения необходимых параметров для образцов с устойчивыми ритмами. Благодаря высокому переходному люминесцентному сигналу легко достичь качества аппроксимации данных выше 90%.

Снятие показаний и замена среды. Обычно мы исключаем данные первого цикла из нашего анализа для представления результатов. При необходимости постройте график зависимости необработанных данных от времени.

Постройте график данных с вычтенной базовой линией, чтобы сравнить амплитуду и фазу как при транзиторной трансфекции клеток 2 9 3 T, так и при инфицировании клеточных линий. Флуоресцентные изображения трансфецированных и трансдуцированных клеток, экспрессирующих GFP, указывают на высокую эффективность системы доставки генов с помощью лентивируса. Основной контур обратной связи циркадных часов состоит из транскрипционных факторов, которые воздействуют на циркадные энхансерные элементы для обеспечения ритмичной экспрессии генов.

В данном случае четыре различных репортерных конструкции в трех клетках T3 обеспечивают разные фазы экспрессии репортера. Новые промежуточные фазы могут быть созданы путем комбинированной регуляции несколькими циркадными элементами с использованием нокдауна генов посредством РНК-интерференции и фармакологически активных соединений. В данном эксперименте для регистрации биолюминесценции клеток U2 OS в чашках диаметром 35 мм использовался люминометр lum cycle.

Irna использовался для изучения эффектов нокдауна генов cry one и cry two. Для регистрации биолюминесценции клеток применялся синергетический люминометр. В 96-луночном планшете находились три репортерные линии клеток T three.

Для оценки влияния тройного нокдауна на клеточные ритмы использовали РНК. В данном примере для регистрации биолюминесценции клеток в 3 84-луночных планшетах применялись система UX и люминометр Tecan. В то время как в указанных планшетах проводился отбор, малые молекулы могут фармакологически воздействовать на функции белков и нарушать клеточные ритмы в репортерных клетках U2 OS.

После своего появления эта методика открыла путь для исследований в области циркадной биологии по изучению механизों молекулярных часов и физиологии в различных типах клеток и тканей. После просмотра этого видео зритель должен получить четкое представление о том, как создавать клеточные линии с люциферазным репортером и осуществлять мониторинг их активности.

Также не забывайте, что работа с вирусами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты и проведение вирусной деконтаминации.