Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Общая цель этого метода заключается в использовании красителей для отслеживания клеток для прямой количественной оценки степени деления клеток для различных подмножеств иммунных клеток в сложных популяциях. Это достигается путем предварительного мечения популяции родительских клеток флуоресцентным красителем, который, как известно, обеспечивает стабильное связывание с клеточными белками или нековалентно интеркалируется в клеточные мембраны для отслеживания меченных красителем клеток, которые реагируют на счетчики стимуляции, окрашивание флуоресцентными антителами и анализ с использованием многопараметрической проточной цитометрии позволяет обнаруживать дифференциальные ответы среди стимулируемых типов иммунных клеток. Но неокрашенные контрольные красители используются для установления самой низкой интенсивности флуоресценции дочерних клеток, которую можно отличить от помеченного автофлуоресцентным красителем, но затем используются нестимулированные контрольные элементы для установления интенсивности флуоресценции, при которой будут обнаружены неразделенные клетки. Стимуляция обычно приводит к широкому диапазону интенсивности, поскольку клетки, пролиферирующие в ответ, становятся все более тусклыми, но те, кто не реагирует, этого не делают.

В конечном счете, использование программного обеспечения для моделирования пиков для оценки относительной частоты клеток в разных поколениях может позволить количественно сравнивать пролиферативные реакции в разных популяциях или стимулах с использованием таких показателей, как индекс пролиферации или частота предшественников. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как тритирование, инкорпорация THY или экспрессия KI 67, заключается в том, что разведение DI обеспечивает прямое измерение деления клеток, которое может быть объединено с другими проточной цитометрической мерой ME, такими как иммунофенотипирование и продукция цитокинов. Визуальная демонстрация метода окрашивания мембранным красителем полезна, так как поглощение красителя клетками происходит чрезвычайно быстро.

Следовательно, хорошая техника является ключом к получению яркого однородного окрашивания. После того, как мононуклеарные клетки периферической крови человека изолируют в центрифуге в течение пяти минут при 300-кратном перегрузке и комнатной температуре, чтобы свести к минимуму загрязнение тромбоцитов. Затем повторно суспендируйте гранулы в соотношении от 10 до седьмых клеток на миллилитр в HBSS плюс 1% BSA, и поместите их на лед.

Извлеките и зарезервируйте 500 микролитров Eloqua, затем переложите еще 500 микролитров аликвоты клеток в коническую полипропиленовую трубку размером 12 на 75 миллиметров. Добавьте 3,5 миллилитра HBSS и раскрутите ячейки в течение пяти минут при 400-кратном G и комнатной температуре во время промывки, добавьте 0,5 миллилитра разбавителя C для маркировки автомобиля из набора PKH 26 GL в другую коническую полипропиленовую трубку размером 12 на 75 миллилитров, тщательно отсадите супернатин, оставив не более 15-25 микролитров остаточной жидкости и стараясь не удалять ни одной клетки. Далее добавьте 0,5 миллилитра разбавителя С мечения носителя в клеточную гранулу и аспирируйте и дозируйте раствор несколько раз до получения одноклеточной суспензии.

Теперь приготовьте два запаса XD, добавив два микролитра PKH 26 в пробирку, содержащую разбавитель С. Только теперь немедленно пипетируйте клеточную суспензию в свежеприготовленный раствор двух красителей XPKH 26 и одновременно аспирируйте и дозируйте смесь несколько раз, чтобы равномерно распределить клетки по всему красителю. Через одну минуту добавьте один миллилитр термоинактивированной сыворотки, чтобы остановить всасывание красителя в клеточные мембраны. После вращения клетки осторожно отсасывают надосадочную жидкость, не удаляя гранулы.

Затем диспергируйте гранулу в четырех миллилитрах готовой среды, содержащей 10% термоинактивированной сыворотки, и перенесите клеточную суспензию в свежую полипропиленовую трубку. Промойте клетки дважды в HBSS плюс 1% BSA, адекватно окрашенные клетки будут иметь отчетливый розовый оттенок в грануле После суспензии клеточной гранулы в одном миллилитре HBSS плюс 1% BSA, подсчитайте клетки, а затем отрегулируйте объем, чтобы получить концентрацию от 10 до 7% клеток на миллилитр. После окрашивания клеток в соответствии с протоколом проточной цитометрии, приведенным в таблице, с помощью первых пяти пробирок задаются параметры прямого и бокового рассеяния, а также сигналы во всех четырех флуоресцентных детекторах.

В частности, для детектора, используемого для контроля флуоресценции PKH 26 во второй трубке. Убедитесь, что все окрашенные клетки PKH 26 отображаются на шкале как один симметричный пик в третьей-четвертой декаде с небольшим количеством клеток или без них в последнем канале. Затем используйте программное обеспечение для компенсации цвета и файлы в режиме списка, собранные для трубок с первой по пятую, чтобы установить матрицу наложения цветов для каждого флуро в детекторах, используемых для мониторинга трех других флуорохромов.

Затем примените эту матрицу к файлу режима списка для примера шесть. Убедиться в том, что наличие мечения PKH 26 не изменяет способность обнаруживать семь A- и D-положительных клеток. Теперь примените эту только что установленную матрицу наложения цветов к файлу режима списка для седьмой трубки.

Определите три положительных CD, четыре отрицательных и три положительных CD, четыре положительных популяции на графике FE и PC. Подтвердите, что наличие анти-CD-3, FE и анти-CD-4 A PC не изменяет способность обнаруживать семь A-D-положительных клеток. Наконец, примените матрицу наложения цветов для трубки семь в режим списка Файл для трубки восемь.

Теперь откройте программу, содержащую модуль анализа распространения. Загрузите окрашенный файл с эффектом PKH 26 из анализируемого набора данных. Далее выберите параметры для анализа, в этом случае ПГК 26 затворяется на жизнеспособных семи а д отрицательных cd, трех положительных лимфоцитах и прямом рассеянии против бокового рассеяния для исключения мелкого мусора и крупных агрегатов.

При определении этих областей будьте осторожны и учитывайте область с высоким передним рассеянием, где обычно обнаруживаются взрывы. Далее откройте мастер распространения. Перейдите на вкладку «Пуск», чтобы открыть файл данных, а затем загрузите нестимулированный положительный контроль PKH 26.

Определите расположение родительского пика, соответствующего неразделенным ячейкам. Проанализируйте файл, отметив значения родительского пикового положения и ширины. Если требуется фиксированная ширина пика, отметьте блокировку SD load на отрицательном регуляторе P KH 26 и отрегулируйте количество поколений, установив пиковый канал для дочерней генерации димуса над отрицательными ячейками PKH 26.

Это задает количество дочерних поколений. Модель может быть точно подогнана после завершения. Перезагрузите стимулированный положительный файл PKH 26.

Если заметны пики поколений, выберите плавающую настройку в разделе «Модель». Если логарифмические декады не совсем равны 4.0, отрегулируйте интервал между поколениями, как описано в статье. Теперь проанализируйте стимулированный образец и убедитесь, что область для родительского пикового положения остается неизменной.

Наконец, выберите «Анализ» для каждого экспериментального файла в наборе данных, который нужно применить. Модель только что создала и записала желаемые метрики распространения, полученные в результате наилучшего соответствия для каждого экспериментального файла в наборе данных. Эта первая серия данных иллюстрирует влияние метода смешивания на распределения флуоресценции PKH 26.

При культивировании U 9 37 миелоидных клеток окрашивали клеточным красителем с использованием только что описанного метода. На этой первой гистограмме показаны неокрашенные контрольные данные. Настройки цитометра были скорректированы таким образом, чтобы разместить автофлуоресценцию от этих клеток в первую декаду, при этом в первом канале не накапливалось или накапливалось очень мало клеток. Эта вторая гистограмма иллюстрирует хорошее окрашивание PKH 26.

Быстрое смешивание двух x ячеек с двумя x красителями дало яркое, однородное и симметричное распределение флуоресценции, но не привело к отклонению от масштаба при настройках инструмента, использованных для предыдущей гистограммы. Когда две x клетки добавляли к двум x красителям без немедленного смешивания, получалось более гетерогенное распределение флуоресценции. Эта небольшая субпопуляция тускло меченых клеток была бы ошибочно интерпретирована как дочерние клетки, если бы они присутствовали в более поздний момент времени на финальной гистограмме этого эксперимента, плохое смешивание также имело место, когда три микролитра концентрированного этанолового красителя были случайно добавлены непосредственно к 0,5 миллилитрам двух x клеточной суспензии, что дало чрезвычайно тусклое и перекошенное вправо распределение интенсивности флуоресценции.

Вот типичные результаты эксперимента по пролиферации, в котором PKH 20 окрашивал мононуклеарные клетки периферической крови человека с стимуляцией или без нее. Показаны реагенты Anti CD three и IL 2. После 96 часов культивирования клетки собирали и окрашивали анти CD тремя FE анти CD 19 A PC и семью A a d.

В первой стратегии стробирования сравнивались две различные стратегии стробирования, точечная диаграмма CD три против семи. A A D использовали для отбора живых семи a d отрицательных CD и трех положительных Т-клеток. Затем была использована прямая и боковая область рассеяния для вытеснения больших агрегатов, в то же время включая бластные лимфоциты.

Реактивные события R один плюс R два для неокрашенного контроля представлены серой гистограммой и окрашенными PKH 26, но нестимулированные клетки выделены синей нотой, ярким симметричным однородным окрашиванием жизнеспособных, но неразделенных Т-клеток в нестимулированном контроле. Эти данные были сбиты таким же образом, как и на предыдущем рисунке, но в этом случае клетки стимулировались анти-CD-3 и IL-2. Гистограмма PKH 26 для R один плюс R два стробированных события теперь содержит в основном разделенные ячейки с пониженной интенсивностью, представленные цветными пиками для каждого дочернего поколения.

Хотя некоторые яркие неразделенные клетки все же остаются в голубом родительском пике. Обратите внимание, что интенсивность сильно разделенных клеток еще не перекрывается с областью, где измеряются неокрашенные клетки, что может затруднить оценку метрик, основанную на количестве клеток в дочерних поколениях с самой низкой интенсивностью. Были проанализированы те же данные, что и на предыдущих двух рисунках, но для отбора жизнеспособных Т-клеток использовались только рассеяние света и CD 3.

Эта стратегия стробирования исключает многие, но не все мертвые клетки, о чем свидетельствует небольшая остаточная популяция из семи A A D положительных мертвых клеток, остающихся в CD на трех против семи точечных графиков A A D. Выбор флуорохромов, используемых для иммунофенотипирования, может создать сложные проблемы компенсации при использовании кристаллов для отслеживания клеток, поскольку интенсивность окрашивания неразделенных клеток чрезвычайно высока. В этом эксперименте мононуклеарные клетки периферической крови возрастом 24 часа помечали PKH 26, а затем окрашивали антителами к CD 3 и CD 4 плюс краситель для жизнеспособности.

В этой серии данных клетки, помеченные двумя микромолярными PKH 26, были окрашены противо-CD тремя FZ 7 A D и анти-CD четырьмя A PC, а затем проанализированы с использованием той же стратегии стробирования R один плюс R два, что и раньше, поскольку перекрытие PKH 26 в канале A PC невелико. Четыре положительных и отрицательных события КД были четко разрешены независимо от того, применялась ли компенсация. Эти данные иллюстрируют, как жизнеспособные CD три положительные CD четыре положительные Т-клетки оставались хорошо разрешенными даже когда конечная концентрация PKH 26 была увеличена до четырех микромоляров. Использование анти-CD 4 на ЦП в комбинации с анти-CD тремя FE двумя микромолярными PKH 26 и жизнеспособностью кристалла до pro 3 дало значительно худшие результаты из-за значительного перекрытия PKH 26 в канале на CP

CD, четыре положительные и отрицательные клетки не могли быть отделены друг от друга в некомпенсированных данных и были лишь незначительно разрешены при применении компенсации. Увеличение конечной концентрации ПЧН 26 до четырех микромоляров приводило к полной потере способности разрешать 4-4 положительные и 4 отрицательные события КД даже после применения компенсации. Обратите внимание, что выборки, включающие или отсутствующие анти-CD четыре на CP, были по существу идентичны.

Когда профиль разбавления красителя анализируется с помощью программного обеспечения для моделирования пиков для оценки частоты клеток в последовательных дочерних поколениях, положения и/или ширина последовательных дочерних пиков могут быть фиксированными или плавающими. Что касается значений для родительского пика. Эти значения оцениваются по нестимулированному контролю.

Например, этот профиль интенсивности PKH 26 взят из нестимулированной 96-часовой культуры от умеренно ответившего пациента и был использован для предоставления мастеру пролиферации mod fit первой оценки положения и ширины пика, представляющего собой неразделенные родительские клетки. Использование фиксированной настройки для положения пика требует, чтобы среднее значение для каждого пика поколения было ровно в два раза меньше интенсивности флуоресценции предыдущего пика. Плавающая настройка для положения пика позволяет изменять конечные положения пиков поколения от ожидаемой интенсивности по мере необходимости для получения наилучшего соответствия.

Аналогично, фиксированная настройка ширины пика требует, чтобы ширина пика каждого поколения была такой же, как ширина родительского или нестимулированного контрольного пика. Плавающая настройка для максимальной ширины позволяет независимо изменять окончательную ширину по мере необходимости для получения наилучшего соответствия в этом столе. Результаты анализа предыдущих данных по двум разным донорам показаны для этих доноров, у которых были очевидны заметные пики поколений.

Наилучшие приведенные значения хи-квадрат были получены, когда положение пика и ширина были допущены к плаванию для профилей пролиферации, где различимые пики поколений не очевидны, рекомендуется фиксированная настройка положения пика. Эти данные иллюстрируют использование двух отслеживающих красителей для раздельного мониторинга истории пролиферации различных типов иммунных клеток в проточно-цитометрическом анализе иммуносупрессии. Т-эффекторные клетки, показанные зеленым цветом, были помечены с помощью CFSE, а Т-регуляторные клетки, показанные синим, были помечены с помощью клеточного изображения.

Популяции меченых кларетом клеток смешивали в различных соотношениях и культивировали в присутствии анти-CD-3, анти-CD-28 и облученных вспомогательных клеток в течение 96 часов. После этого клетки собирали и окрашивали анти-CD 4, PE размера 7 и живой мертвой фиалкой. Здесь. Репрезентативные данные для отношения трега к Т-эффектору 0,25 к одному показаны после гейтирования живых мертвых фиолетовых положительных клеток.

Был применен затвор светового рассеяния, который включал лимфоциты и бласты, но исключал агрегаты и обломки, а затем включал затвор для включения CD 4 положительных событий. Бордовое окрашивание позволило легко отличить жизнеспособные T-эффекторные клетки от жизнеспособных Т-эффекторных клеток, которые были высоко пролиферированы, и поэтому профили пролиферации CFSE DIM для CFSE положительных Т-эффекторных клеток и Claret положительных трег-клеток были проанализированы с помощью программного обеспечения для моделирования пиков mod fit. Было проанализировано около 25 000 событий.

Из них 48% были жизнеспособными Т-эффекторами, 6% были жизнеспособными Т-регами, а остальное представляли собой мертвые клетки, добавочные клетки и мусор. Расчетный индекс пролиферации, отражающий кратное увеличение количества клеток за период анализа, составил 3,85 для Т-эффекторов и 1,83 для Tregs. Здесь показано влияние концентрации трегс-клеток на индекс пролиферации Т-эффекторных клеток, рассчитанный по профилю разбавления красителя CFSE.

Результаты были одинаковыми, независимо от того, были ли трег-клетки помечены клеточным видом кларета или остались неокрашенными, что указывает на то, что функция трега не была изменена при окрашивании. При ожидаемом отслеживании степень пролиферации текторов увеличивалась по мере снижения концентрации трег-клеток. Индексы пролиферации трэг-клеток также рассчитывались по профилям разбавления бордового красителя в клетках при различных соотношениях трэг и Т-эффекторов.

Как и ожидалось, Tregs претерпели минимальную пролиферацию в отсутствие Т-эффекторных клеток по мере увеличения концентрации Т-эффекторных клеток. Тем не менее, степень пролиферации трег-клеток также увеличивалась. После просмотра видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно использовать красители для отслеживания клеток для мониторинга пролиферации клеток, как выбрать подходящие флуорохромы и элементы управления цветовой компенсацией, а также как выбрать подходящую модель для количественной оценки деления клеток на основе разбавления красителя.

Наряду с этой процедурой могут быть выполнены и другие методы для ответа на экспериментальные вопросы, такие как окрашивание антиген-специфичных Т-клеток или сортировка потоком для восстановления стволовых клеток, которые находятся в состоянии покоя или медленно делятся. Большое спасибо за просмотр.