Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Общая цель данного метода заключается в использовании красителей для отслеживания клеток с целью прямого количественного определения степени деления различных подмножеств иммунных клеток в составе сложных популяций. Это достигается путем предварительного мечения родительской популяции клеток флуоресцентным красителем, который стабильно связывается с клеточными белками или нековалентно интеркалирует в клеточные мембраны. Для отслеживания меченых клеток, реагирующих на стимуляцию, используются контроли; окрашивание флуоресцентными антителами и последующий анализ с помощью многопараметрической проточной цитометрии позволяют выявить различия в ответах между стимулированными иммунными клетками интересующих типов. Немеченые контрольные образцы используются для определения минимальной интенсивности флуоресценции дочерних клеток, которую можно отличить от автофлуоресценции. Меченые, но нестимулированные контроли затем используются для установления интенсивности флуоресценции, при которой будут определяться неделившиеся клетки. Стимуляция обычно приводит к широкому диапазону интенсивностей, так как клетки, пролиферирующие в ответ на стимул, становятся прогрессивно более тусклыми, в то время как нереагирующие клетки сохраняют интенсивность свечения.

В конечном итоге, использование программного обеспечения для моделирования пиков с целью оценки относительной частоты клеток в разных поколениях позволяет проводить количественное сравнение пролиферативных ответов в различных популяциях или при воздействии разных стимулов, используя такие показатели, как индекс пролиферации или частота предшественников. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как включение тритиевого тимидина или экспрессия KI 67, является то, что разведение мембранного красителя обеспечивает прямое измерение деления клеток, которое может быть совмещено с другими методами проточной цитометрии, такими как иммунофенотипирование и определение продукции цитокинов. Визуальная демонстрация метода окрашивания мембранным красителем полезна, поскольку захват красителя клетками происходит чрезвычайно быстро.

Следовательно, правильная техника является залогом получения яркого гомогенного окрашивания. После выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека центрифугируйте их в течение пяти минут при 300 ×g и комнатной температуре, чтобы минимизировать загрязнение тромбоцитами. Затем ресуспендируйте осадок в концентрации 10⁷ клеток/мл в HBSS с добавлением 1% BSA и поместите их на лед.

Удалите и зарезервируйте аликвоту объемом 500 µL, затем перенесите другую аликвоту клеток объемом 500 µL в коническую полипропиленовую пробирку размером 12 × 75 мм. Добавьте 3,5 мл HBSS и центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 400 ×g и комнатной температуре. Для промывки добавьте 0,5 мл разбавителя C (labeling vehicle) из набора PKH 26 GL в другую коническую полипропиленовую пробирку размером 12 × 75 мм. Осторожно аспирируйте супернатант, оставив не более 15–25 µL остаточной жидкости и стараясь не удалить клетки. Затем добавьте 0,5 мл разбавителя C (labeling vehicle) к клеточному осадку, несколько раз аспирируйте и дозируйте раствор для получения одноклеточной суспензии.

Теперь приготовьте 2-кратный стоковый раствор XD, добавив 2 µL PKH 26 в пробирку с разбавителем C. Сразу после этого перенесите суспензию клеток в свежеприготовленный 2-кратный раствор красителя PKH 26, одновременно несколько раз аспирируя и дозируя смесь для равномерного распределения клеток в красителе. Через одну минуту добавьте 1 mL термоинактивированной сыворотки, чтобы остановить поглощение красителя клеточными мембранами. После центрифугирования осторожно удалите супернатант, не затрагивая осадок.

Затем ресуспендируйте осадок в четырех миллилитрах полной среды, содержащей 10% инактивированной сыворотки, и перенесите клеточную суспензию в новую полипропиленовую пробирку. Промойте клетки дважды в HBSS с добавлением 1% BSA; достаточно окрашенные клетки будут иметь отчетливый розовый оттенок в осадке. После повторного ресуспендирования клеточного осадка в одном миллилитре HBSS с добавлением 1% BSA подсчитайте количество клеток, а затем отрегулируйте объем, чтобы получить конечную концентрацию 10⁷ клеток на миллилитр. После окрашивания клеток согласно протоколу проточной цитометрии, изложенному в таблице, используйте первые пять пробирок для настройки параметров прямого (forward scatter) и бокового (side scatter) светорассеяния, а также сигналов во всех четырех флуоресцентных детекторах.

В частности, для детектора, используемого для мониторинга флуоресценции PKH 26 в пробирке два. Убедитесь, что все окрашенные PKH 26 клетки отображаются на шкале в виде одного симметричного пика в третьем-четвертом десятичном интервале, при этом в последнем канале находится мало клеток или они отсутствуют. Затем с помощью программного обеспечения для цветовой компенсации и файлов в режиме списка, собранных для пробирок с первой по пятую, установите матрицу перекрытия цветов для каждого флуорохрома в детекторах, используемых для мониторинга трех других флуорохромов.

Затем примените эту матрицу к файлу в режиме списка для шестого образца. Это необходимо для подтверждения того, что наличие метки PKH 26 не влияет на возможность обнаружения клеток, положительных по 7-AAD. Теперь примените только что созданную матрицу перекрытия цветов к файлу в режиме списка для седьмой пробирки.

Идентифицируйте популяции CD3-положительных CD4-отрицательных и CD3-положительных CD4-положительных клеток на графике FE против PC. Подтвердите, что присутствие анти-CD3 FE и анти-CD4 PC не влияет на возможность обнаружения клеток, положительных по 7-AAD. Наконец, примените матрицу перекрытия цветов для пробирки 7 к файлу в режиме списка (list mode file) для пробирки 8.

Теперь откройте программу, содержащую модуль анализа пролиферации. Загрузите из набора данных файл со стимулированными клетками, окрашенными PKH 26, для проведения анализа. Затем выберите параметры анализа: в данном случае это PKH 26 с гейтированием по живым 7-AAD-отрицательным CD3-положительным лимфоцитам, а также прямое светорассеяние (forward scatter) в сравнении с боковым светорассеянием (side scatter) для исключения мелкого дебриса и крупных агрегатов.

При определении этих областей будьте внимательны, чтобы включить зону с высоким прямым светорассеянием, где обычно располагаются бласты. Затем откройте мастер пролиферации. Перейдите на вкладку «start», чтобы открыть файл данных, и загрузите положительный контроль PKH 26 без стимуляции.

Определите положение родительского пика, соответствующего не делившимся клеткам. Проанализируйте файл, зафиксировав значения положения и ширины родительского пика. Если требуется установить фиксированную ширину пика, отметьте «lock SD», загрузите отрицательный контроль PKH 26 и отрегулируйте количество поколений, установив канал пика для поколения дочерних клеток с пониженной интенсивностью окрашивания выше уровня клеток отрицательного контроля PKH 26.

Это задает количество дочерних поколений. Модель может точно подогнать данные после завершения. Загрузите повторно файл с положительным сигналом PKH 26 после стимуляции.

Если наблюдаются отчетливо различимые пики поколений, выберите настройку floating в опциях модели. Если логарифмические десятилетия не равны точно 4,0, скорректируйте интервал между поколениями, как описано в статье. Теперь проанализируйте стимулированный образец и убедитесь, что область положения родительского пика остается неизменной.

Наконец, выберите «analyze» для каждого экспериментального файла в наборе данных, чтобы применить созданную модель и записать соответствующие показатели пролиферации, полученные в результате наилучшего соответствия для каждого экспериментального файла в наборе данных. Эта первая серия данных иллюстрирует влияние метода смешивания на распределение флуоресценции PKH 26.

При культивировании миелоидные клетки U 9 37 окрашивали красителем для отслеживания клеток по только что описанному методу; на первой гистограмме представлены данные неокрашенного контроля. Настройки цитометра были отрегулированы таким образом, чтобы автофлуоресценция этих клеток находилась в первом десятилетии, при этом в первом канале накапливалось очень мало клеток или они отсутствовали вовсе. Вторая гистограмма демонстрирует качественное окрашивание PKH 26.

Быстрое смешивание 2x клеток с 2x красителем привело к яркому, гомогенному и симметричному распределению флуоресценции, при этом при настройках прибора, использованных для предыдущей гистограммы, клетки за пределами шкалы отсутствовали. При добавлении 2x клеток к 2x красителю без немедленного перемешивания было получено более гетерогенное распределение флуоресценции. Эта небольшая субпопуляция слабомеченых клеток была бы ошибочно интерпретирована как дочерние клетки, если бы они присутствовали на более позднем временном отрезке в итоговой гистограмме данного эксперимента; плохое перемешивание также наблюдалось при случайном добавлении 3 µL концентрированного стокового раствора красителя в этаноле непосредственно к 0,5 mL суспензии 2x клеток, что привело к крайне слабому распределению интенсивности флуоресценции с правым скосом.

Здесь представлены типичные результаты эксперимента по изучению пролиферации, в котором окрашенные PKH 20 мононуклеарные клетки периферической крови человека культивировали с использованием стимуляторов или без них. Показаны реагенты анти-CD3 и IL2. После 96 часов культивирования клетки собирали и окрашивали контрастными антителами анти-CD3 FE, анти-CD19 APC и seven A a d.

Были compared две различные стратегии гейтирования. В первой стратегии гейтирования на точечной диаграмме CD3 против 7-AAD использовали 7-AAD для выбора живых 7-AAD-отрицательных CD3-положительных T-клеток. Затем область прямого и бокового светорассеяния использовалась для исключения крупных агрегатов при сохранении бластных лимфоцитов.

События в гейте R1+R2 для немаркированного контроля представлены серым гистограммой, а клетки, окрашенные PKH 26, но не стимулированные — синим цветом; обратите внимание на яркое симметричное гомогенное окрашивание жизнеспособных, но не делившихся T-клеток в нестимулированном контроле. Эти данные были отобраны по тем же критериям (гейтам), что и на предыдущем рисунке, но в данном случае клетки стимулировали с помощью anti-CD3 и IL-2. Гистограмма PKH 26 для событий в гейте R1+R2 теперь содержит преимущественно делившиеся клетки с пониженной интенсивностью окрашивания, что представлено цветными пиками для каждого дочернего поколения.

Хотя в синем родительском пике все еще остаются некоторые яркие неделившиеся клетки. Обратите внимание, что интенсивность клеток, подвергшихся многократному делению, еще не пересекается с областью измерения неокрашенных клеток, что в противном случае затруднило бы оценку показателей на основе количества клеток в дочерних поколениях с самой низкой интенсивностью. Эти же данные были проанализированы аналогично двум предыдущим наборам рисунков, но для отбора жизнеспособных T-клеток использовались только боковое светорассеяние и CD3.

Данная стратегия гейтирования исключает многие, но не все погибшие клетки, что подтверждается небольшой остаточной популяцией семи-AAD-положительных мертвых клеток, видимой на точечных диаграммах CD3 против 7-AAD. Выбор флуорохромов для иммунофенотипирования может создать серьезные проблемы с компенсацией при использовании красителей для отслеживания клеток, поскольку интенсивность окрашивания неделящихся клеток чрезвычайно высока. В данном эксперименте мононуклеарные клетки периферической крови, полученные спустя 24 часа, были помечены PKH26, а затем подвергнуты контр-окрашиванию антителами к CD3 и CD4 в сочетании с красителем жизнеспособности.

В этой серии данных клетки, помеченные 2 µM PKH 26, были подвергнуты контрмечению антителами anti-CD3 FITC и anti-CD4 APC, после чего были проанализированы с использованием той же стратегии гейтирования R1 + R2, что и ранее. Поскольку перекрытие сигнала PKH 26 в канале APC минимально, CD4-положительные и CD4-отрицательные события были четко разделены независимо от применения компенсации. Эти данные демонстрируют, что жизнеспособные CD3-положительные CD4-положительные T-клетки оставались хорошо разрешимыми даже при увеличении конечной концентрации PKH 26 до 4 µM. Использование anti-CD4 PerCP в сочетании с anti-CD3 FITC, 2 µM PKH 26 и красителем жизнеспособности Propidium Iodide дало гораздо худшие результаты из-за значительного перекрытия сигнала PKH 26 в канале PerCP.

CD4-положительные и CD4-отрицательные клетки не могли быть разделены в некомпенсированных данных и были разделены лишь незначительно после применения компенсации. Увеличение конечной концентрации PKH 26 до четырех мкМ привело к полной потере способности дифференцировать CD4-положительные и CD4-отрицательные события даже после применения компенсации. Обратите внимание, что образцы с добавлением или без добавления анти-CD4 на клетку (per CP) были практически идентичны.

При анализе профиля разведения красителя с помощью программного обеспечения для моделирования пиков с целью оценки частоты клеток в последовательных дочерних поколениях, положение и/или ширина последовательных дочерних пиков могут быть фиксированными или плавающими относительно значений родительского пика. Эти значения определяются на основе нестимулированного контроля.

Например, данный профиль интенсивности PKH 26 получен из нестимулированной 96-часовой культуры умеренного респондера и использовался для предоставления мастеру аппроксимации пролиферации (mod fit proliferation wizard) первой оценки положения и ширины пика, представляющего неделящиеся родительские клетки. Использование фиксированной настройки положения пика требует, чтобы среднее значение каждого генерационного пика составляло ровно половину интенсивности флуоресценции предыдущего пика. Плавающая настройка положения пика позволяет конечным позициям генерационных пиков отклоняться от ожидаемых интенсивностей, если это необходимо для достижения наилучшего соответствия.

Аналогично, при фиксированной настройке ширины пика ширина каждого генерационного пика должна быть такой же, как у родительского пика или пика нестимулированного контроля. Плавающая настройка ширины пика позволяет независимо изменять конечную ширину по мере необходимости для достижения наилучшего соответствия в данной таблице. Результаты анализа предыдущих фигур для двух разных доноров представлены для тех доноров, у которых наблюдались отчетливые генерационные пики.

Наилучшие значения редуцированного хи-квадрата были получены, когда и положение пика, и его ширина были свободными параметрами; для профилей пролиферации, в которых четко выраженные генерационные пики отсутствуют, рекомендуется использовать фиксированное значение положения пика. Эти данные иллюстрируют использование двух трекерных красителей для раздельного мониторинга истории пролиферации различных типов иммунных клеток в анализе иммуносупрессии методом проточной цитометрии. Т-эффекторные клетки, показанные зеленым цветом, были помечены CFSE, а Т-регуляторные клетки, показанные синим цветом, были помечены CellView.

Клетки, меченные красителем Claret, смешивали в различных соотношениях и культивировали в присутствии анти-CD3, анти-CD28 и облученных вспомогательных клеток в течение 96 часов. После этого клетки собирали и окрашивали анти-CD4, PE size seven и live dead violet. Здесь представлены репрезентативные данные для соотношения Treg к T-эффекторам 0,25:1 после исключения Live Dead Violet-положительных клеток.

Был применен гейт по светорассеянию, включающий лимфоциты и бласты, но исключающий агрегаты и клеточный детрит, с последующим выделением событий, положительных по CD4. Окрашивание CellView Claret позволило легко отличить жизнеспособные Treg-клетки от жизнеспособных эффекторных T-клеток, которые интенсивно пролиферировали; таким образом, профили пролиферации CFSE-DIM для CFSE-положительных эффекторных T-клеток и CellView Claret-положительных Treg-клеток были проанализированы с помощью программного обеспечения для моделирования пиков ModFit Peak. Было проанализировано примерно 25 000 событий.

Из них 48% составили жизнеспособные Т-эффекторы, 6% — жизнеспособные Т-регуляторы, а остальные представляли собой погибшие клетки, вспомогательные клетки и клеточный детрит. Рассчитанный индекс пролиферации, отражающий кратность увеличения количества клеток за период анализа, составил 3,85 для Т-эффекторов и 1,83 для Т-регуляторов. Здесь показано влияние концентрации Т-регуляторных клеток на индекс пролиферации Т-эффекторных клеток, рассчитанный по профилю разведения красителя CFSE.

Результаты были одинаковыми независимо от того, были ли treg-клетки помечены красителем Cell View Claret или остались неокрашенными, что указывает на то, что окрашивание не изменило функцию treg-клеток. При отслеживании, как и ожидалось, степень пролиферации T-эффекторных клеток увеличивалась по мере снижения концентрации treg-клеток. Индексы пролиферации treg-клеток также были рассчитаны на основе профилей разведения красителя Cell View Claret при различных соотношениях treg-клеток к T-эффекторным клеткам.

Как и ожидалось, в отсутствие T-эффекторных клеток Treg-клетки подвергались минимальной пролиферации по мере увеличения концентрации T-эффекторных клеток. Однако степень пролиферации Treg-клеток также возрастала. После просмотра видео вы должны получить четкое представление о том, как успешно использовать красители для трекинга клеток для мониторинга их пролиферации, как выбирать подходящие флуорохромы и контроли компенсации цветов, а также как выбрать подходящую модель для количественной оценки деления клеток на основе разведения красителя.

Наряду с данной процедурой могут быть применены и другие методы для решения экспериментальных задач, такие как окрашивание антигенспецифических T-клеток или сортировка методом проточной цитометрии для выделения стволоподобных клеток, находящихся в состоянии покоя или медленно делящихся. Большое спасибо за просмотр.