Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях

Общая цель данной демонстрации — сравнить три различных метода анализа пролиферации клеток и представить преимущества и недостатки каждого из них. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, такие как выбор наиболее подходящего способа оценки пролиферации клеток. Подготовка к выполнению данного метода имеет решающее значение, так как этапы работы с анализатором клеток (cell imager) требуют тщательного освоения.

Перед применением соответствующей маски для подсчета клеток необходимо сфокусироваться на клетках. Чтобы начать эту процедуру, культивируйте две линии клеток MCF-7 в течение трех дней до достижения 75–80% конфлюэнтности в квадратных флаконах для культивирования тканей T75 с использованием среды DMEM без фенолового красного. Через три дня удалите клетки из флаконов, слив среду в контейнер для отходов.

Затем немедленно промойте слой клеток двумя миллилитрами предварительно подогретого двухкратного раствора трипсина. Отсосите трипсин и добавьте к слою клеток еще два миллилитра предварительно подогретого трипсина, после чего поместите их в инкубатор. Как только клетки открепятся, промойте их 10 миллилитрами подогретой свежей среды DMEM с добавками.

Затем перенесите суспензию клеток в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. По истечении пяти минут осторожно аспирируйте и утилизируйте супернатант. После этого повторно суспендируйте осадок клеток в пяти миллилитрах свежей среды DMEM с добавками.

Для подсчета клеток разведите 100 µL клеточной суспензии в 900 µL 1× DPBS. Затем установите новый датчик с диаметром отверстия 60 мкм в автоматический счетчик клеток. Нажмите на поршень и погрузите датчик в разведенную клеточную суспензию.

Медленно отпустите поршень счетчика клеток. По завершении извлеките датчик из счетчика клеток. Рассейте клетки в 96-луночный планшет в конечном объеме 100 µL при конфлюэнтности около 20%, чтобы оставить место для роста клеток и измерения пролиферации в течение трех-пяти дней.

Для определения количества клеток с помощью гемоцитометра предварительно прогрейте среду и трипсин до 37 °C в инкубаторе для культур клеток, сухожаровом шкафу или на водяной бане. Затем аспирируйте среду из лунок с клетками в контейнер для отходов. После этого один раз промойте клетки, используя 30 µL двухкратного раствора трипсина, и снова аспирируйте среду в контейнер для отходов.

Затем снова промойте клетки 30 µL трипсина (2×) и инкубируйте их в течение пяти минут при 37 °C. Осторожно постучите по краю планшета, чтобы отделить клетки. После этого добавьте 50 µL supplemented DMEM и перемешайте клетки путем пипетирования до образования суспензии из отдельных клеток.

Поместите покровное стекло поверх камер для подсчета и прижмите его до появления колец Ньютона между краями покровного стекла и гемоцитометром. Затем осторожно внесите пипеткой 20 µL суспензии клеток под покровное стекло, позволяя камере заполниться за счет капиллярного эффекта. После этого изучите камеры для подсчета с сеткой при 10-кратном увеличении.

В данной процедуре разморозьте люминесцентный реагент на водяной бане при температуре 22 °C в течение 30 минут. Осторожно переверните флакон, чтобы получить однородную смесь. Затем выдержите один планшет с высеянными клетками при комнатной температуре в течение 30 минут для уравновешивания.

После этого добавьте в каждую лунку по 100 µL люминесцентного реагента. Перемешайте содержимое на орбитальном шейкере в течение двух минут. Затем инкубируйте планшет в течение 10 минут при комнатной температуре.

Для настройки эксперимента по люминесценции с помощью программного обеспечения многофункционального планшетного ридера включите прибор и запустите программу. В диспетчере задач (Task Manager) выберите «Experiments» (Эксперименты) и «Create New» (Создать новый). Затем выберите «File» (Файл) на боковой панели инструментов и во вкладке «Protocol» (Протокол) выберите «Procedure» (Процедура).

Затем выберите в качестве типа планшета «Greiner 96 flat bottom» и установите флажок «Use Lid». В поле «Read method» выберите действие «Read». Далее выберите «Luminescence» в качестве метода детекции и нажмите «OK». В окне «Read Step» на вкладке «Full Plate» выберите лунки для сканирования, а затем выберите лунки, которые будут служить холостыми пробами.

Установите параметр Filter Set в положение Empty Filter. Установите Gain на значение 135, Integration Time — 5 секунд на лунку, а Read Height — 6,5 millimeters. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки для измерения люминесценции.

Для проведения измерения люминесценции извлеките держатель планшета, перейдя на вкладку Instrument Control и нажав Plate Out. Установите 96-луночный планшет в держатель, убедившись, что крышка закрыта. Закройте держатель планшета, нажав Plate In на вкладке Instrument Control.

Затем нажмите «Read Now» на панели инструментов, чтобы выполнить люминесцентное считывание. После этого экспортируйте значения RLU для каждой лунки в таблицу для дальнейшего анализа. Для подготовки эксперимента по визуализации клеток включите мультимодальный имиджер клеток и откройте соответствующее программное обеспечение.

В Диспетчере задач выберите вкладку Experiments и нажмите Create New. На панели инструментов File перейдите на вкладку Protocol, а затем на вкладку Procedure. Выберите действие Set Temperature.

Включите инкубатор и установите температуру на 37 °C. Отметьте пункт «Preheat» (Предварительный нагрев), затем нажмите OK, чтобы сохранить настройки. Далее выберите действие «Read» (Считывание).

Выберите Image (Изображение) в качестве метода детекции. Затем выберите Endpoint/Kinetic (Конечная точка/Кинетика) в качестве типа считывания и Filters (Фильтры) в качестве типа оптики, после чего нажмите OK. Затем перейдите на вкладку Full Plate (Весь планшет) и выберите лунки планшета, которые необходимо визуализировать. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки.

Теперь в выпадающем списке Objectives выберите объектив 2.5x. На вкладке Channels выберите GFP 469.525 и Bright Field. Для обоих каналов установите флажок Auto Exposure и выберите лунку для автоэкспозиции.

Для определения настроек автоматической фокусировки нажмите Options. В параметрах автоматической фокусировки выберите метод Scan, а затем auto focus. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки.

После этого установите горизонтальное и вертикальное смещение относительно центра лунки на ноль. Выберите сканирование нескольких изображений на лунку в виде монтажа три на два. Затем нажмите ОК, чтобы сохранить настройки процедуры.

Чтобы считать результаты эксперимента на выбранном планшете, перейдите на вкладку Instrument Control и выберите функцию Plate Out. Поместите 96-луночный планшет на держатель, убедившись, что крышка закрыта. На вкладке Instrument Control выберите функцию Plate In.

Затем на вкладке планшета выберите «Read Now» (Прочитать сейчас) и повторяйте считывание каждые 24 часа в течение 96 часов после посева. Чтобы проанализировать изображение, перейдите на вкладку «Data» (Данные) соответствующего планшета и выберите «Picture GFP 469, 525 plus Bright Field». После этого дважды щелкните по нужному лунке на изображении.

Теперь нажмите на загруженное изображение. Выберите Analyze, а затем выберите отдельный снимок из монтажа для анализа. Затем нажмите OK. После этого отметьте только канал GFP и установите параметры, указанные в таблице 3.

После этого нажмите Start, чтобы применить параметры к изображениям клеток. Оцените маску подсчета клеток, наложенную на изображения, которая используется для определения количества клеток на одном снимке. Нажмите Apply Changes и сохраняйте эти настройки для каждого планшета, снимаемого на протяжении всего эксперимента.

На данном рисунке представлен линейный регрессионный анализ, проведенный для сравнения корреляционных связей между различными методами, использованными для измерения пролиферации клеток MCF-7-LeGO и клеток MCF-7-delta 40p53. Был рассчитан коэффициент корреляции Пирсона и определена значимость различий между разными методами измерения пролиферации клеток. Наиболее сильная корреляция наблюдалась при сравнении люминесцентного анализа и анализа с использованием анализатора клеток.

Здесь представлены репрезентативные изображения GFP-положительных клеток рака молочной железы линий MCF-7-LeGO и MCF-7-delta 40p53, полученные с помощью анализатора клеток каждые 24 часа до достижения клетками почти 100% конфлюэнтности. Данный метод предоставляет полезную информацию о клетках, включая возможность визуального мониторинга клеточного роста в течение нескольких дней, а также сравнения размера и морфологии клеток различных клеточных линий. Здесь приведено резюме преимуществ и недостатков каждого протестированного метода, которое демонстрирует универсальность каждого из подходов и поможет читателям выбрать наиболее подходящий метод.

После просмотра этого видео вы должны хорошо разобраться в трех различных методах анализа пролиферации клеток и сможете определить, какой из них лучше всего подходит для вашего собственного плана эксперимента.