Сравнение трех различных методов для определения пролиферации клеток рака молочной железы в клеточных линиях

Общая цель этой демонстрации состоит в том, чтобы сравнить три различных анализа пролиферации клеток и представить преимущества и недостатки каждого метода. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, такие как использование наиболее подходящего метода пролиферации клеток. Подготовка к этому методу имеет решающее значение, так как этапы работы с камерой визуализации клеток сложны для изучения.

Они требуют, чтобы вы сосредоточились на клетках, прежде чем применять соответствующую маску для подсчета клеток. Чтобы начать эту процедуру, вырастите две клеточные линии MCF-7 в течение трех дней до 75-80% слияния в колбах для культуры тканей площадью Т75 квадратного сантиметра с использованием DMEM, не содержащего фенола красного. Через трое суток извлеките клетки из колб, высыпав среду в контейнер для отходов.

Затем, сразу же промойте клеточный слой двумя миллилитрами предварительно подогретого два раза трипсина. Аспирируйте трипсин, и добавьте еще два миллилитра предварительно подогретого трипсина в клеточный слой перед помещением его в инкубатор. Как только клетки отсоединится, промойте их 10 миллилитрами подогретого свежего дополненного ДМЭМ.

Затем переложите клеточную суспензию в стерильную 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте ее в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут тщательно аспирируйте и утилизируйте надосадочную жидкость. После этого повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах свежей добавки DMEM.

Чтобы провести подсчет клеток, разведите 100 микролитров клеточной суспензии в 900 микролитрах однократного DPBS. Затем установите новый 60-микрометровый датчик на автоматический счетчик ячеек. Зажмите поршень и погрузите датчик в разбавленную суспензию ячеек.

Медленно отпустите поршень на счетчике ячеек. Затем, когда закончите, снимите датчик со счетчика ячеек. Засейте клетки в конечном объеме 100 микролитров в 96-луночный планшет с конфлюенсацией около 20%, чтобы обеспечить место для роста клеток и измерения пролиферации в течение трех-пяти дней.

Чтобы определить количество клеток с помощью гемоцитометра, предварительно нагрейте среду и трипсин до 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур, духовке или водяной бане. Затем отсасывайте среду из клеток в контейнер для отходов. Затем промойте их один раз 30 микролитрами трипсина и снова отсадите среду в контейнер для отходов.

Далее снова промойте клетки 30 микролитрами двукратного трипсина, и инкубируйте их в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Аккуратно постучите по краю пластины, чтобы сместить ячейки. Впоследствии добавьте 50 микролитров дополненного DMEM и перемешайте клетки с помощью пипетирования до образования одноклеточной суспензии.

Поместите стеклянную крышку на счетные камеры и закрепите ее до тех пор, пока между краями защитного стекла и гелоцитометром не будут видны кольца преломления Ньютона. Затем аккуратно пипеткой нанесите 20 микролитров супенсии под крышку и дайте заполнить счетную камеру капиллярным движением. Затем визуализируйте счетные камеры в схеме сетки при 10-кратном увеличении.

При этой процедуре разморозьте люминесцентный реагент на водяной бане при температуре 22 градуса Цельсия в течение 30 минут. Аккуратно переверните бутылку до получения однородной смеси. Затем уравновесьте одну пластину засеянных клеток при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого добавьте в каждую лунку по 100 микролитров люминесцентного реагента. Перемешивайте содержимое на орбитальном шейкере в течение двух минут. Затем дайте тарелке поинкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре.

Чтобы настроить эксперимент по люминесценции с помощью программного обеспечения для чтения многорежимных пластин, включите многорежимный считыватель пластин и откройте программу. В диспетчере задач выберите Эксперименты и Создать новый. Затем выберите Файл на боковой панели инструментов, а на вкладке Протокол выберите Процедура.

Затем выберите плоское дно Greiner 96 в качестве типа тарелки и установите флажок Использовать крышку. Выберите действие Чтение в поле Метод чтения. Затем выберите «Люминесценция» в качестве метода обнаружения и нажмите OK.In поле «Шаг чтения», выберите лунки для сканирования на вкладке «Полная пластина» и выберите скважины, которые будут действовать как пустые скважины.

Установите для параметра Фильтр Пустой фильтр. Установите коэффициент усиления на 135 с временем интегрирования 5 секунд на лунку и высотой считывания 6,5 миллиметров. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки для считывания люминесценции.

Чтобы выполнить люминесцентное считывание, извлеките держатель пластины, выбрав вкладку «Управление прибором», и нажмите кнопку «Вытащить пластину». Поместите 96-луночный планшет на держатель тарелки, убедившись, что крышка закрыта. Закройте держатель пластины, нажав «Plate In» на вкладке «Управление прибором».

Затем нажмите «Прочитать сейчас» на панели инструментов, чтобы выполнить люминесцентное чтение. После этого экспортируйте измерения RLU для каждой скважины в электронную таблицу для дальнейшего анализа. Чтобы настроить эксперимент по визуализации клеток, включите многорежимный имидж-сканер клеток и откройте программу.

В Диспетчере задач выберите вкладку Эксперименты и Создать новый. На панели инструментов «Файл» перейдите на вкладку «Протокол», а затем на вкладку «Процедура». Выберите действие Установить температуру.

Установите инкубатор в положение Вкл, а затем установите температуру на 37 градусов по Цельсию. Установите флажок «Предварительный нагрев», затем нажмите «ОК», чтобы сохранить настройки. Затем выберите действие Прочитать.

Нажмите на «Изображение» в качестве метода обнаружения. Затем выберите тип чтения Endpoint/Kinetic и тип оптики Filters и нажмите OK. После этого перейдите на вкладку Full Plate (Полная пластина) и выберите скважины на пластине для создания изображения. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки.

Теперь выберите цель в 2,5 раза из выпадающего списка «Цели». На вкладке «Каналы» выберите GFP 469.525 и «Яркое поле». Установите флажок Автоматическая экспозиция для обоих каналов и выберите ячейку автоматической экспозиции.

Чтобы определить настройки автофокусировки, нажмите «Параметры». В качестве параметров автофокусировки выберите метод Сканирование, а затем Автофокусировка. Нажмите OK, чтобы сохранить настройки.

После этого установите горизонтальное и вертикальное смещение от центра лунки в ноль. Выберите, чтобы сканировать несколько изображений на лунку в монтаже три на два. Затем нажмите OK, чтобы сохранить настройки процедуры.

Чтобы прочитать эксперимент на выбранной пластине, перейдите на вкладку «Управление прибором» и выберите функцию «Выход пластины». Поместите 96-луночную пластину на держатель тарелки, убедившись, что крышка закрыта. На вкладке «Управление прибором» выберите функцию «Вход пластины».

Затем выберите «Прочитать сейчас» на вкладке пластины и повторяйте чтение каждые 24 часа, вплоть до 96 часов после посева. Чтобы проанализировать изображение, перейдите на вкладку «Данные» на изображенной пластине и выберите «Изображение GFP 469, 525 плюс яркое поле». Затем дважды кликните по изображенному углублению.

Теперь нажмите на загруженное изображение. Выберите «Анализировать», а затем выберите одно изображение монтажа для анализа. Затем нажмите OK. После этого проверьте только канал GFP и установите параметры, как показано в таблице 3.

После этого нажмите кнопку Пуск, чтобы применить параметры к отображаемым ячейкам. Наблюдайте за маской подсчета клеток, размещенной над отображаемыми ячейками, которая используется для определения количества клеток на изображении. Нажмите кнопку Применить изменения и сохраните эти настройки для каждой пластины, отображаемой на протяжении всего эксперимента.

На этом рисунке был проведен линейный регрессионный анализ для сравнения корреляционных отношений между различными методами, рассмотренными для измерения пролиферации клеток в клетках MCF-7-LeGO и MCF-7-delta 40p53. Был рассчитан коэффициент корреляции Пирсона, и была определена значимость между различными методами измерения пролиферации клеток. Наиболее сильная корреляция наблюдалась между сравнением люминесцентного анализа и клеточного тепловизора.

Здесь представлены репрезентативные изображения GFP-положительных клеток рака молочной железы MCF-7-LeGO и MCF-7-delta 40p53, полученные с помощью клеточного сканера каждые 24 часа до тех пор, пока клетки не достигнут близкого к 100% слиянию. Этот метод предоставляет полезную клеточную информацию, в том числе возможность визуального мониторинга роста клеток в течение нескольких дней и сравнения размера и морфологии клеток между различными клеточными линиями. Здесь приведено краткое изложение преимуществ и недостатков каждого тестируемого метода, что демонстрирует универсальность каждого из методов и поможет читателям выбрать наиболее подходящий метод.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о трех различных анализах пролиферации клеток и должны быть в состоянии определить, какой из них лучше всего подходит для вашего собственного экспериментального плана.