Поколение человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с помощью STEMCCA Lentiviral векторного

В данном протоколе демонстрируется способ эффективного получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из четырех миллилитров периферической крови. В нулевой день изолируйте мононуклеарные клетки из образца периферической крови и проведите их экспансию. Трансдуцируйте первичные клетки вектором для репрограммирования.

На девятый день перенесите трансдуцированные клетки на инактивированные эмбриональные фибробласты мыши и культивируйте их примерно три недели. Отоберите HESC-подобные колонии для экспансии и характеристики. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на экспрессию маркеров плюрипотентности, таких как SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81.

Продемонстрируйте эффективное получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Использование антивирусного вектора для стволовых клеток при генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека обладает несколькими преимуществами по сравнению с другими существующими методами. Пожалуй, наиболее привлекательным является общая простота данного подхода, так как он требует легкого доступа к донорским тканям, а именно — легкодоступных образцов периферической крови.

Наиболее важными характеристиками данного метода являются эффективность перепрограммирования и качество полученных клонов ИПС-клеток. Процедуру продемонстрируют Андреа Дженьюэри Саммер, постдокторант моей лаборатории, и Сара Розелл, аспирантка из лаборатории Джорджа Мёрфи. Все действия выполняются в нулевой день.

Отоберите 4 мл периферической крови в вакутайнер для подготовки клеток с цитратом натрия. В течение двух часов после забора крови переверните пробирку 8–10 раз. Центрифугируйте образец при 1 800 G в течение 30 минут при комнатной температуре для сбора мононуклеарных клеток.

Откачайте плазму и пипеткой извлеките лейкоцитарный слой (buffy coat) — слой клеток между гелевым барьером и плазмой. Перенесите лейкоцитарный слой в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и доведите общий объем до 10 мл стерильным PBS. Несколько раз переверните пробирки и центрифугируйте при 300 G в течение 15 минут.

Ресуспендируйте клеточный осадок в 10 миллилитрах стерильного PBS, проведите подсчет клеток, а затем перенесите от 1 до 2 × 10⁶ клеток в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте осадок в двух миллилитрах экспансионной среды. Затем высейте выделенные мононуклеарные клетки в одну лунку 12-луночного планшета и культивируйте при 37 °C и 5% CO2.

Соберите оставшиеся клетки путем центрифугирования и заморозьте стоки из примерно двух × 10⁶ клеток на флакон в FBS, содержащей 10% DMSO, на третий и шестой дни. Перенесите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и один раз промойте лунку одним миллилитром среды для стволовых клеток QBSF 60. Чтобы собрать адгезивные клетки.

Соберите клетки путем центрифугирования, ресуспендируйте клеточный осадок в двух миллилитрах em. Затем перенесите клеточную суспензию в одну лунку 12-луночного планшета и верните культуру в инкубатор на девятый день. Перенесите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и один раз промойте лунку одним миллилитром среды для стволовых клеток QB SF 60. Для сбора прилипших клеток центрифугируйте культуру при 300 G в течение 10 минут.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл свежей среды EM, содержащей 5 мкг/мл полибрена и лентивирус STEM с MOI от 1 до 10. После этого перенесите суспензию в одну лунку 12-луночного планшета и центрифугируйте при 2 250 об/мин в течение 90 минут при 25 °C. Добавьте еще 1 мл свежей среды EM, содержащей 5 мкг/мл полибрена, чтобы общий объем EM составил 2 мл, и поместите планшет в инкубатор для культур клеток на 10-й день.

После сбора клеток, как показано ранее, ресуспендируйте осадок клеток в двух миллилитрах культуральной среды EM. Трансдуцированные клетки из одной лунки 12-луночного планшета на 11-й день: покройте лунки 6-луночного планшета 0,1% желатином, затем высейте инактивированные эмбриональные фибробласты мыши из расчета 2 × 10⁵ клеток на лунку в среде meth. Подготовьте по три лунки для каждой инфекции.

На следующий день соберите трансдуцированные мононуклеарные клетки, как показано ранее. После центрифугирования ресуспендируйте клеточный осадок в трех миллилитрах среды meth, содержащей bFGF, аскорбиновую кислоту и факторы роста.

Теперь аспирируйте среду из планшета MES, используя 1 мл OFM с MC на лунку. Затем добавьте 1,5 мл полной среды с метионином и центрифугируйте планшет при 500 RPM при 25 °C в течение 30 минут. После этого культивируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение двух дней, начиная с 14-го дня.

Обновляйте среду каждые два дня, добавляя 2,5 milliliters среды meth, содержащей 10 nanograms per milliliter BFGF и 50 micrograms per milliliter аскорбиновой кислоты, но без факторов роста. Примерно на 20-й день, после появления небольших колоний, ежедневно подкармливайте клетки двумя milliliters среды для эмбриональных стволовых клеток человека в период между 30-м и 40-м днями. Отберите каждую колонию и перенесите в отдельные лунки 12-луночного планшета, предварительно заполненного инактивированным maths, содержащим one milliliter среды HESC с добавлением ингибитора ROCK; подкармливайте клетки ежедневно.

После этого, при использовании одного миллилитра среды HESC без ингибитора ROCK, полученные из человеческих моноцитов плюрипотентные стволовые клетки становятся готовы к иммунофлуоресцентному окрашиванию на маркеры плюрипотентности, а также к эксцизии интегрированной репрограммирующей кассеты. В ходе данного протокола клетки претерпевают ряд морфологических изменений: от P BMCs до генерации человеческих I PSCs. В день 0 изолированные мононуклеарные клетки периферической крови культивируют в экспансионной среде в течение девяти дней.

Наблюдаются гроздья клеток, напоминающие виноградные кисти, что свидетельствует о жизнеспособности и пролиферации клеток перед трансдукцией. Примерно через 21 день после посева клеток на матрикс Альбрехта (MA) начинают формироваться колонии. К 30-му дню колонии иПСК демонстрируют типичную морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток человека.

Данный иммунофлуоресцентный анализ иПСК, полученных из PBMC, демонстрирует экспрессию маркеров плюрипотентности SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81. иПСК также окрашиваются положительно на щелочную фосфатазу. На этих изображениях показаны этапы получения иПСК без трансгенов путем трансфекции плазмидой, коэкспрессирующей CRE-рекомбиназу и ген устойчивости к пуромицину, как описано в работе Summers et al. 2010; по сравнению с иПСК до трансфекции наблюдается гибель клеток.

После двух дней селекции пуромицином, новые колонии, состоящие из резистентных клеток, появляются примерно через 10 дней после трансфекции. Саузерн-блот анализ отобранных колоний подтверждает вырезание трансгена: дорожки 1, 3, 5 и 7 демонстрируют наличие трансгена в клонах ИПСК до его вырезания. Эти полосы отсутствуют на дорожках 2, 4, 6 и 8 после вырезания трансгена. После просмотра этого видео вы сможете стабильно и эффективно получать высококачественные нормальные или болезнь-специфичные ИПСК человека из небольшого объема периферической крови любого индивидуума.

Данный подход упрощает процесс репрограммирования, делая его общедоступным для сообщества исследователей стволовых клеток. В то же время он обеспечивает основу для получения более гомогенных популяций линий стволовых клеток.