Анализы клеточной популяции на скинхед канцерогенеза

Канцерогенеза представляет собой процесс, включающий взаимодействие между раковыми клетками и рак микросреды. Препарировать молекулярных событий, нужно изолировать различные клеточные популяции на разных этапах развития рака. Используя модель мыши для базально-клеточная карцинома, мы опишем протокол для сотовых анализы во время канцерогенеза.

Общая цель этой процедуры заключается в проведении анализа клеточной популяции на мышиной модели базальноклеточного рака кожи. Это достигается путем сначала индуцирования экспрессии генов-мишеней у мышей. На втором этапе эпидермис изолируется от кожи мыши.

После создания одиночной клеточной суспензии эпидермальные клетки помечаются специфическими маркерами клеточной службы. В конечном счете, изменения клеточной популяции во время развития опухоли в коже можно контролировать с помощью проточного цитометрического анализа. Развитие рака – это процесс, в котором участвуют многие типы клеток.

Цель этой процедуры – помочь исследователю выяснить, как различные клетки способствуют развитию рака кожи. Этот метод может дать представление о клеточных взаимодействиях во время развития рака кожи, но также может быть применен к другим системам, таким как рак поджелудочной железы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как трудно определить, когда эксперимент должен быть прекращен без визуальной оценки.

Начнем с того, что мыши с кератином 14 Cree ER называются мышами K 14, а мыши Rosa 26 содержат меченный YFP мутантный сглаженный ген SMU M, два называются SMU. Мышей. Затем погрузите образцы хвоста длиной 0,5 сантиметра, собранные у трех-шестинедельных двойных положительных мышей, в раствор для прямого лизиса хвоста ПЦР с одним миллиграммом на миллилитр протеиназы К. Затем инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 55 градусов Цельсия с встряхиванием. На следующий день вращайте ткань на максимальной скорости в микроцентрифуге, чтобы удалить мусор.

Затем для генотипирования каждого животного используйте один микролитр SNAT из каждого образца в индивидуальных ПЦР-реакциях с праймерами и условиями, рекомендованными поставщиком. Используйте изогнутую иглу для кормления 20 калибра для введения тамоксифена животным. Дважды положительный результат на K 14 C er и ROSA 26 при пероральном зондировании в течение пяти дней подряд для индуцирования экспрессии OO M two в кератиноцитах.

В целом, фенотипы более выражены на ухе и хвосте мышей, помеченных GFP K 14 OO для сбора кожи для клеточного анализа. Во-первых, используйте тремор, чтобы удалить шерсть с усыпленного животного. Затем снимите с мыши кожицу и погрузите ткань в раствор дисбе при температуре 37 градусов Цельсия на один-два часа.

После процедуры dispa с помощью щипцов отделите эпидермис от дермы. Теперь с помощью ножниц измельчите эпидермис. Затем погрузите ткань в четырехкратный раствор коллагеназы на один-два часа при температуре 37 градусов Цельсия в 50-миллилитровую пробирку.

Аккуратно вращайте трубку каждые 20 минут, чтобы диссоциировать клетки. Используйте микроскоп для подтверждения диссоциации клеток, когда отдельные клетки могут быть обнаружены в коллагеназной среде. Инкубируйте образец еще 30 минут, чтобы увеличить выход клеток.

Затем отфильтровать тканевую смесь через клеточное ситечко 70 микрон и промыть клетки в течение 10 минут при температуре 500 G и комнатной температуры для маркировки клеток начать с помощью резуса, суспензив только что промытую гранулу в PBS с добавлением 10% FBS в 2,5 умножить на 10 из шести клеток на миллилитр. Затем поместите раствор клетки на лед на 30 минут, чтобы заблокировать любое неспецифическое связывание. Далее перенесите аликвоты клеток в микропробирки объемом 1,5 миллилитра для мечения специфическими антителами.

Добавление антител в каждую пробирку в конечной концентрации два микрограмма на миллилитр. Осторожно переведите пробирки на несколько секунд, чтобы смешать антитела с клетками, а затем поместите пробирки обратно на лед еще на 30 минут. После промывки пробирок в одном миллилитре PBS повторно суспендируйте гранулы в PBS, а затем добавьте DPI в конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр.

При анализе данных сначала выберите отдельные ячейки на основе графика прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния, исключая мертвые ячейки с положительным DABI. У мышей не развивается базальноклеточная карцинома, за исключением тех случаев, когда активируется сигнализация ежа, как видно на этих изображениях. Индуцированная тамоксифеном экспрессия онкогенного разглаженного гладкого M two YFP приводит к фенотипу кожи, который проявляется даже на анатомическом уровне роста у окрашенных образцов кожи этих животных.

Опухоли кожи могут наблюдаться у мышей K 14 SMU. Без индукции SMU M two YFP кожа животного не проявляла аномальной морфологии по h и e. Окрашивание этих точечных диаграмм показывает репрезентативный анализ миелоидных клеток у нормальных мышей и мышей с опухолями.

CD 11 B положительные GR one положительные клетки получены из миелоидных клеток, некоторые из которых являются миелоидными супрессорными клетками у нормальных и не-smu M two YFP мышей. Популяция CD 11 B положительных GR one положительных клеток едва обнаруживается, но увеличивается в ответ на воспаление или развитие опухоли. У мышей K 14 SMU.

Индуцированная экспрессия smu, M, 2, YFP и кератиноцитов в коже приводит к увеличению популяции CD 11 B положительных GR one. Эта методика позволит исследователям в области биологии кожи проводить молекулярный анализ В-клеточной карциномы у мышей.