Высокопроизводительный рабочий процесс визуализации и анализа для оценки фенотипов клеток кожи и состояний пролиферации в образцах тканей

Этот протокол сочетает в себе метод мультиплексной оптической визуализации, IBEX и мечение Click-iT EDU для обнаружения и категоризации типов делящихся клеток в высокодинамичных процессах, таких как восстановление кожи. Кроме того, мы предоставляем новый конвейер обработки изображений с открытым исходным кодом для получения и анализа изображений с высокой пропускной способностью. Смажьте 24 лунки пластину 200 микролитрами хромового алюминиевого желатина и выдержите пластину в течение 15 минут на коромысле.

Затем полностью удалите желатин и просушите покрытые глазурью лунки в течение 60 минут в 40-градусной духовке. Разрежьте встроенную в ОКТ ткань толщиной от 15 до 30 микрометров в криостате и быстро перенесите ее в лунку с покрытием, содержащую два миллилитра PBS. Осторожно извлеките PBS с помощью пипетки объемом в один миллилитр, стремясь сохранить участок ткани по центру лунки.

Чтобы сделать это эффективно, медленно отсасывайте PBS от краев лунки, регулируя положение пипетки по мере необходимости, чтобы предотвратить смещение ткани. Высушите срезы ткани в течение часа в духовке при температуре 37 градусов Цельсия. Регидратируйте с помощью одного миллилитра PBS в течение пяти минут.

Пропитайте ткань 500 микролитрами 0,5% Тритона в течение 30 минут при комнатной температуре. Коротко промойте салфетку дважды PBS и выполните реакцию Click-iT в течение 30 минут при комнатной температуре. Храните образцы в защищенном от света месте.

Коротко промойте салфетку дважды PBS. Заблокируйте на один час блокирующим буфером при комнатной температуре. Добавьте первичные антитела для первого цикла.

И инкубируйте тарелку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Постирайте с PBS три раза. Проведите вторичное окрашивание антителами.

Для первого цикла нанесите вторичные антитела для несвязанных первичных антител вместе с ядерным противокрасителем. Инкубируйте образцы в защищенном от света месте в течение 60 минут при комнатной температуре. Промойте салфетку три раза одним миллилитром PBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Оставьте в каждой лунке около 500 микролитров PBS и поднесите пластину к микроскопу. В программном обеспечении Meta Express нажмите «Скрининг», а затем «Настройка приобретения». Нажмите на кнопку «Извлечь».

Очистите дно пластины 70% этанолом и вставьте пластину в микроскоп. Нажмите кнопку Загрузить пластину. На вкладке «Объектив и камера» выберите нужное увеличение.

В качестве режима сбора данных выберите режим конфокальной щели 51 микрометр. На вкладке Пластина выберите модель пластины. Перейдите на вкладку Plates Sites Visit.

В разделе «Параметры сайта» нажмите на «Фиксированное количество сайтов». Установите количество столбцов и строк таким образом, чтобы была охвачена примерно вся лунка. Нажмите на перекрывающиеся участки 10%Выберите только первую скважину для получения, щелкнув правой кнопкой мыши по соответствующей скважине на карте пластин.

Перейдите на вкладку «Автофокусировка захвата». Для автофокусировки «скважина-колодец» выберите вариант «пластина и дно скважины». Для автофокусировки на сайте выберите параметр «Все сайты».

Перейдите на вкладку «Длины волн» и выберите количество красителей, которые будут отображаться в текущем цикле. Перейдите на первую вкладку длины волны. Выберите лазер со смещением по оси Z для позиционирования по оси Z и нажмите кнопку «Рассчитать смещение», чтобы задать правильную высоту изображения.

Выберите изображение, на котором образец лучше всего сфокусирован. Нажмите кнопку «Фокус». Отображается изображение ткани в фокусе.

Установите мощность подсветки на 50%Установите целевую максимальную интенсивность на 2000 и нажмите Auto Expose. Для серии Z выберите серию Z и 2D-проекционное изображение, а для коррекции затенения выберите только затенение FL. Повторите эти шаги для других длин волн, но вместо лазера со смещением по оси Z выберите смещение по оси Z от W1 и выберите ноль.

Перейдите к шагу Z-серии и введите желаемый размер шага. Нажмите кнопку «Фокус». Перетаскивайте стрелку текущего положения до тех пор, пока не достигнете нижней части ткани, и нажмите кнопку «Установить B».

Перетащите стрелку положения в верхнюю часть ткани и нажмите кнопку Set T. Нажмите F2, Стоп, снова нажмите Start Live. Убедитесь, что ступень находится на первом колодце, щелкнув по нему левой кнопкой мыши.

Найдите границу ткани и отметьте все участки, содержащие ткань, для извлечения, щелкнув правой кнопкой мыши. Перейдите на вкладку Run и введите имя пластины. Нажмите «Сохранить протокол».

Настройте регион сбора для всех остальных скважин. Запустите Control, Journal, начните запись и сразу же Control, Journal, остановите запись. Сохраните созданный журнал и откройте его снова через Управление, Журнал, Редактировать журнал.

На левой панели перейдите в раздел Plate Acquisition, загрузите протокол из файла и нажмите Plate Acquisition, чтобы добавить эти шаги в журнал. Дважды щелкните мышью по кнопке «Редактировать получение пластины», загрузите протокол из файла и выберите протокол, сохраненный для первой скважины. Повторите эти шаги для каждой скважины, которую необходимо получить, всегда загружая соответствующий протокол.

Нажмите на кнопку Run Journal, чтобы начать приобретение. За 30 минут до окончания дневника приступайте к приготовлению отбеливающего реагента. Растворите 10 миллиграммов борогидрида лития в 10 миллилитрах двойной дистилляции H2O и пропустите через фильтр 0,22 микрометра.

Оставить на 10 минут. В растворе должны начать образовываться пузырьки. Чтобы обеспечить эффективное отбеливание, используйте отбеливающий реагент в течение четырех часов после приготовления.

Добавьте отбеливающий раствор к образцам и инкубируйте в течение 15 минут, держа образцы под воздействием окружающего освещения. На ткани должны появиться мелкие пузырьки. Вымыть отбеленные образцы трижды одним миллилитром PBS в течение пяти минут, каждый при комнатной температуре.

Добавьте первичные антитела для следующего цикла и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Мультиплексная визуализация IBEX в сочетании с мечением Click-iT EDU выявляет различные структуры и пролиферирующие типы клеток в поврежденной коже. Мечение EDU на криоконсервированных образцах аналогично при выполнении иммунофлуоресцентного мечения антителами для KI-67 на срезах тканей, залитых парафином, а также при мечении клеток KI 67 с помощью проточной цитометрии.

Использование этого протокола позволяет точно обнаруживать пролиферацию клеток в сложных биологических процессах. Более того, конвейер обработки изображений с открытым исходным кодом не требует никакого опыта программирования и генерирует файлы, которые могут быть обработаны с помощью некоммерческого программного обеспечения, такого как Fiji и quPath. Кроме того, этот протокол не требует дорогостоящего оборудования и, следовательно, может быть выполнен в большинстве исследовательских условий.