CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации пролиферации клеток и паттернов экспрессии белков на уровне отдельных клеток в трех измерениях, а также в точной оценке анатомии и патологии кожи. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как клеточные и молекулярные механизмы контролируют развитие и регенерацию эпидермиса и как эти механизмы нарушаются во время кожных заболеваний. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она представляет собой технически простой протокол визуализации отдельных клеток в биопсии кожи полной толщины в трех измерениях с беспрецедентной точностью.

Метод также облегчает исследование взаимодействий между эпидермисом и дермой в полных образцах кожи. Как правило, исследователи, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности при подготовке небольших биопсий плоской кожи без повреждения волосяных фолликулов. Демонстрировать процедуру будет Бетти Маклариос, аспирант отделения развития и регенеративной дерматологии в Университете Нового Южного Уэльса в Австралии.

Начните с использования триммеров, чтобы сбрить волосы с шеи усыпленной мыши, стараясь не ранить кожу. Затем обеззаритите кожу 70% этанолом и PBS. Затем подтяните кожу спинной части шеи с помощью щипцов и с помощью ножниц удалите участок спинной кожи мыши размером примерно 1,5 на 4 см.

Затем расплющите кожу дермой вниз на листе фильтровальной бумаги, отмечая переднюю заднюю ориентацию образца, и обрежьте бумагой вокруг рассеченной кожи. Для оптимальной визуализации образцы кожи должны оставаться плоскими с постоянной ориентацией волосяных фолликулов. Для поддержания образцов в правильном передне-заднем положении мы фиксируем кусочки кожи на фильтровальной бумаге в прямоугольных биопсиях.

Перенесите образцы в пробирку объемом 15 мл, наполненную свежеприготовленными 4%-ными PFA и PBS. Затем, когда они будут прочно закреплены на фильтровальной бумаге, переложите образцы в новую пробирку PBS объемом 15 мл на две пятиминутные промывки. Чтобы очистить биопсию кожи, после второго промывания острым лезвием бритвы разрежьте ткани примерно на кусочки размером 0,2 на 0,5 см, следя за тем, чтобы более длинные стороны образцов были разрезаны вдоль переднего заднего направления образцов.

Разрез по бокам биопсии параллельно ориентации волосяных фолликулов также помогает избежать обширного повреждения волосяных фолликулов. Они погружают биопсию в 5 мл свежеприготовленного кубического раствора для очистки в новую пробирку объемом 15 мл и помещают пробирку на вращающуюся платформу в печи для гибридизации при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как кусочки ткани становятся прозрачными, биопсию проводят в 4 мл PBS в течение четырех шестичасовых промываний при 37 градусах Цельсия, а затем в течение четырех часов 37 градусов Цельсия с содержанием сахарозы и PBS в объеме 20% веса на объем.

В конце инкубации заморозьте каждый образец в компаунде с оптимальной температурой резки в отдельных пробирках объемом 15 мл на ночь при температуре 80 градусов Цельсия для повышения проницаемости тканей для проникновения антител. На следующее утро окрашивайте образцы кожи соответствующими антителами и жизненно важными красителями, представляющими интерес. Затем инкубируйте образцы в 1 мл свежеприготовленного кубического раствора для очистки в пробирках объемом 2 мл в шейкере в течение 24 часов в духовке при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы выровнять показатель преломления тканей.

Когда ткани расположены в чистом положении, биопсия вдоль длинной стороны отдельного стеклянного покрова скользит таким образом, что направление роста волосяного фолликула параллельно поверхности скольжения покрова. Нанесите одну каплю кубического раствора на ткань. Поместите две полоски размером 1 мл на 2 см синей липкой ленты на покровную пластинку, затем накройте биопсию второй защитной пленкой.

Затем поместите камеру визуализации на предметный столик для конфокального микроскопа и переместите ткань в световой путь. Используя соответствующий источник света и стандартные эпифлуоресцентные фильтры, отсканируйте образец, чтобы определить флуоресцентно окрашенные области интереса, а затем получите флуоресцентные конфокальные изображения интересующих областей. С помощью этого метода можно осветлить биопсию кожи взрослых мышей дикого типа и окрашивать их антителами против базального маркера кератиноцитов кератина 14.

Пятнистые положительные ядра видны по всему образцу и позволяют оценить некоторые анатомические особенности, такие как дермальные сосочки. Окрашивание K14 проявляется в базальном слое межфолликулярного эпидермиса толщиной в одну клетку. Контурирование сальных желез и наружных корневых оболочек волосяных фолликулов и вторичных волосяных зачатков с низким уровнем экспрессии K14 обнаруживается в области выпуклости волосяных фолликулов.

Чтобы визуализировать пролиферирующие клетки на всю толщину, можно провести биопсию кожи на телогене взрослых мышей дикого типа, как показано на рисунке, выявив наличие пролиферирующих кератиноцитов в базальном межфолликулярном эпидермисе и в перешейке, но не в области выпуклости волосяных фолликулов. Для визуализации полной толщины сальных желез можно провести биопсию кожи на антигене взрослых мышей дикого типа и окрашивать, что способствует обнаружению сальных желез в области перешейка волосяных фолликулов. Для визуализации морфологических изменений эпидермиса и трансгенных животных можно осветлить и окрашивать биопсию дорсальной кожи на всю толщину, выявляя гиперплазию межфолликулярного эпидермиса и аномальных волосяных фолликулов с мечеными K14 клеточными массами, простирающимися проксимально в дерму, представляя собой увеличенные популяции трансгенных стволовых клеток.

После просмотра этого видео мы должны хорошо понять, как готовить и осветлять образцы кожи, а также визуализировать паттерны экспрессии белков при разрешении одной клетки в трех измерениях. Этот метод прост в исполнении и использует относительно безопасные и недорогие реагенты. В будущем будет проверено больше антител на их совместимость с этим методом, что позволит расширить этот анализ для визуализации большего количества белков и определенных типов интереса.

Другие методы визуализации, такие как световая листовая микроскопия, могут быть выполнены для визуализации анатомии кожи и паттернов экспрессии белков более крупных образцов кожи в трех измерениях. После его разработки этот метод проложит путь исследователям в области дерматологии к изучению клеточных и молекулярных взаимодействий между дермой и эпидермисом в гомеостазе кожи, в генетически модифицированных моделях мышей и в одной из наших моделей кожных заболеваний.