CUBIC Протокол Визуализирует экспрессии белка в одной резолюции клетки в тотальных препаратах кожи Маунт

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации пролиферации клеток и паттернов экспрессии белков на уровне отдельных клеток в трех измерениях, а также в точной оценке анатомии и патологии кожи. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о том, как клеточные и молекулярные механизмы контролируют развитие и регенерацию эпидермиса и как эти механизмы нарушаются при заболеваниях кожи. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой технически простой протокол для трехмерной визуализации отдельных клеток в биоптатах кожи полной толщины с беспрецедентной точностью.

Данный метод также облегчает исследование взаимодействий между эпидермисом и дермой в образцах полноценной кожи. Как правило, исследователям, которые только начинают использовать этот метод, может быть сложно подготовить небольшие плоские биоптаты кожи, не повредив волосяные фолликулы. Процедуру продемонстрирует Бетти Маклариос, аспирант подразделения дерматологии развития и регенерации Университета Нового Южного Уэльса (UNSW), Австралия.

Начните с того, что с помощью триммера сбрейте шерсть на шее эвтаназированной мыши, стараясь не повредить кожу. Затем продезинфицируйте кожу 70% ethanol и PBS. После этого приподнимите кожу в дорсальной области шеи пинцетом и с помощью ножниц удалите участок кожи спины мыши размером примерно 1,5 x 4 см.

Затем разгладьте кожу дермальной стороной вниз на листе фильтровальной бумаги, отметив передне-заднюю ориентацию образца, и обрежьте бумагу по контуру препарированной кожи. Для получения оптимальных изображений образцы кожи должны оставаться плоскими с единообразной ориентацией волосяных фолликулов. Чтобы сохранить образцы в правильном передне-заднем положении, мы фиксируем фрагменты кожи на фильтровальной бумаге в виде прямоугольных биоптатов.

Перенесите образцы в пробирку объемом 15 мл, наполненную свежеприготовленным 4% PFA и PBS. После того как ткани будут надежно зафиксированы на фильтровальной бумаге, перенесите образцы в новую пробирку объемом 15 мл с PBS для двух пятиминутных промывок. Для просветления биоптатов кожи после второй промывки с помощью острого лезвия разрежьте ткани на фрагменты размером примерно 0,2 на 0,5 см, следя за тем, чтобы длинные стороны образцов были разрезаны вдоль переднезаднего направления.

Разрез вдоль стороны биоптата параллельно ориентации волосяных фолликулов также помогает избежать их значительного повреждения. Затем погрузите биоптаты в 5 mL свежеприготовленного очищающего раствора Cubic One в новой пробирке объемом 15 mL и поместите пробирку на роторную платформу в гибридизационной печи при 37 °C. После того как фрагменты ткани станут прозрачными, промойте биоптаты в 4 mL PBS четыре раза по шесть часов при 37 °C, после чего проведите четырехчасовую промывку при 37 °C в 20% (вес/объем) растворе сахарозы в PBS.

По окончании инкубации заморозьте каждый образец в соединении для оптимальной температуры среза (OCT) в отдельных пробирках объемом 15 mL на ночь при температуре -80 °C для повышения проницаемости тканей для антител. На следующее утро окрасьте образцы кожи соответствующими антителами и интересующими витальными красителями. Затем инкубируйте препараты в 1 mL свежеприготовленного осветляющего раствора Cubic 2 в пробирках объемом 2 mL на шейкере в течение 24 часов в термостате при 37 °C для выравнивания показателя преломления тканей.

Когда ткани станут прозрачными, расположите биоптаты вдоль длинной стороны отдельных стеклянных покровных стекол так, чтобы направление роста волосяного фолликула было параллельно поверхности покровного стекла. Нанесите одну каплю раствора cubic two на ткань. Нанесите две полоски синей так-липкой массы размером 1 mL на 2 cm на покровное стекло, затем накройте биоптат вторым покровным стеклом.

Затем поместите камеру для визуализации на предметный столик конфокального микроскопа и переместите ткань в тракт светового луча. Используя соответствующий источник света и стандартные эпифлуоресцентные фильтры, просканируйте образец для поиска флуоресцентно окрашенных областей интереса, после чего получите конфокальные флуоресцентные изображения этих областей. С помощью данного метода можно провести просветление и окрашивание антителами к маркеру базальных кератиноцитов keratin 14 биоптатов спины взрослых мышей дикого типа.

По всему образцу видны ядра, положительные по DAPI, что позволяет оценить некоторые анатомические особенности, такие как дермальные сосочки. Окрашивание на K14 выражено в однослойном базальном слое межфолликулярного эпидермиса. Оно очерчивает сальные железы и наружные корневые оболочки волосяных фолликулов, а также вторичные зачатки волоса, при этом в области выпуклости (bulge) волосяных фолликулов обнаруживается лишь низкий уровень экспрессии K14.

Для визуализации пролиферирующих клеток биоптаты спинной кожи взрослого дикого типа мышей полной толщины, взятые в фазе телогена, можно осветлить и окрасить, как показано в инструкции, что позволит выявить наличие пролиферирующих кератиноцитов в базальном межфолликулярном эпидермисе и в перешейке, но не в области выпуклости волосяных фолликулов. Для визуализации сальных желез биоптаты спинной кожи взрослого дикого типа мышей полной толщины, взятые в фазе анэгена, можно осветлить и окрасить, что облегчит обнаружение сальных желез в области перешейка волосяных фолликулов. Для визуализации морфологических изменений в эпидермисе трансгенных животных биоптаты спинной кожи полной толщины можно осветлить и окрасить, что позволит выявить гиперплазию межфолликулярного эпидермиса и аномальные волосяные фолликулы с массами клеток, меченых K14, которые распространяются проксимально в дерму, представляя собой увеличенные популяции трансгенных стволовых клеток.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать и очищать образцы кожи, а также визуализировать паттерны экспрессии белков с разрешением до одной клетки в трех измерениях. Данный метод прост в исполнении и предполагает использование относительно безопасных и недорогих реагентов. В дальнейшем будут протестированы дополнительные антитела на совместимость с этим методом, что позволит расширить анализ для визуализации большего количества белков и специфических типов тканей.

Для визуализации анатомии кожи и паттернов экспрессии белков в более крупных образцах кожи в трехмерном пространстве могут быть использованы другие методы визуализации, такие как микроскопия светового листа. После ее разработки эта методика позволит исследователям в области дерматологии изучить клеточные и молекулярные взаимодействия между дермой и эпидермисом при гомеостазе кожи, в генетически модифицированных моделях мышей и в одной из наших моделей заболевания кожи.