Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133 ⁺ Предполагаемые раковых стволовых клеток от меланомы

Общая цель этой процедуры заключается в создании бактериальных культур, полученных от злокачественных меланом, и выделении предполагаемых CD 1 33 положительных раковых стволовых клеток. Это достигается путем предварительного получения первичных одиночных клеток меланомы из опухолевой ткани после истощения эритроцитов из клеточной гранулы. При необходимости охарактеризовать первичную клеточную культуру и истощить фибробласты.

Заключительным этапом является проведение магнитной сортировки клеток CD 1 33 положительных и CD 1 33 отрицательных клеток меланомы. В конечном счете, эта оптимизированная процедура max является отличным методом получения высокообогащенных и жизнеспособных популяций CD 1 33 положительных и CD 1 33 отрицательных клеток. Впервые мы использовали эту технику для проверки данных insco в персонализированной медицине, где мы пытаемся предсказать реакцию на лекарства у онкологических больных, и для этого не может быть использована коммерчески доступная клеточная линия.

Основное преимущество метода заключается в том, что у нас есть быстрый доступ к CD1 33 положительным клеткам, которые являются предполагаемыми раковыми стволовыми клетками при злокачественной меланоме. Методику представит Кэтрин Дэвис, лаборант из моей лаборатории. Перенесите свежевыделенную опухолевую ткань из операционной в лабораторию культуры тканей в стерильном PBS, содержащем 1% пенициллин стрептомицина.

Перенесите опухолевую ткань в стерильную чашку Петри, отасывайте излишки раствора. Затем добавьте 500 микролитров диссоциационной смеси и измельчите опухоль на мелкие кусочки по два-четыре миллиметра с помощью свежих стерильных скальпелей. Теперь перенесите от двух до четырех граммов измельченной опухолевой ткани в мягкую пробирку max C, содержащую пять миллилитров диссоциативной смеси.

Промойте чашку Петри еще 4,5 миллилитровой диссоциативной смесью и добавьте оставшиеся фрагменты ткани в нежную трубку max C. Закройте трубку, приложите ее вверх ногами к втулке диссоциации и запустите программу H опухоли ноль один. Затем инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном вращении на максимальной скорости работы.

Теперь приложите трубку вверх ногами к втулке диссоциации и запустите программу Н опухоли ноль два. Затем инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном вращении со скоростью 12 об/мин. Далее запустите щадящую максимальную программу H опухоли ноль три.

Повторно суспендируйте образец и пропустите клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр 70 микрон в 50-миллилитровую пробирку. При необходимости перемешайте клеточную суспензию стерильным фильтрующим наконечником до тех пор, пока вся суспензия не протечет. Промойте клеточное ситечко пятью миллилитрами квантовой 2 6 3 средней гранулы клеточной суспензии в течение пяти минут при 300 G и выбросьте надосадочную жидкость.

Если небо клетки кажется прочитанным из-за большого количества тиков и лжи, красные кровяные тельца как подробно описано в сопутствующем текстовом протоколе. Повторно вращают опухолевые клетки в квантах 2, 6, 3 и засевают культуру, регулярно пропуская клетки, когда они достигают 80% конфлюенции. Фенотипически проанализировать первичную клеточную культуру с помощью микроскопа.

Затем соберите небольшое количество первичной клеточной культуры для экстракции РНК после синтеза CD NA и выполните R-T-P-C-R с праймерами для генов неопластической меланомы, стволовых клеток и маркеров стромальных клеток. Наиболее важными генами для анализа являются маркер фибробластов CD 90, маркер меланомы и меланоцитов, разрывающий маркер раковых стволовых клеток CD 1 33, маркер зрелых дендритных клеток, CD 83 и бытовой ген, такой как HPRT или GAAP dh. Если комбинированный микроскопический анализ и анализ R-T-P-C-R выявили высокую контаминацию первичной культуры меланомы фибробластами, то приступают к истощению фибробластов с помощью антифибробластов, микрогранул и колонок LD.

Промойте 80%-ные клетки слияния с предварительно подогретым PBS, добавьте соответствующее количество аккутана и инкубируйте до тех пор, пока клетки не отделятся от поверхности культуры. Соберите клетки в среду quantum 2, 6, 3 и переложите в 50-миллилитровую пробирку. Перечислите клетки, затем центрифугируйте необходимое количество клеток в течение пяти минут при 300 G и четырех-восьми градусах Цельсия.

Аспирация надосадочной жидкости полностью и ресус. Суспензируйте до одного раза по 10 до восьмой клетки в 350 микролитров макс. буфера, добавьте 100 микролитров реагента-блокатора FCR и 50 микролитров CD 1:33. Один биотин.

Хорошо перемешайте и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Промойте клетки с максимальным содержанием буфера 10 миллилитров, а затем центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 300 G и от четырех до восьми градусов Цельсия. Полностью отасуньте надосадочную жидкость после повторного промывания.

Ресуспендируйте клеточную гранулу в 400 микролитрах максимального буфера. Добавьте 100 микролитров микрогранул антибиотина и хорошо перемешайте, инкубируйте при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия в течение 15 минут. Тем временем, чтобы подготовить сепаратор max к магнитной сепарации, прикрепите quadro max к стойке multis сепаратора max.

Вставьте необходимое количество колонок с крыльями колонки вперед в магнитное поле квадро макс. Поместите фильтр предварительной сепарации в каждую колонну LS и соответствующую сборную трубку. Под каждой колонкой промойте фильтр и колонку с максимальным буфером в три миллилитра и удалите сквозной поток.

После промывки клеток в максимальном буфере, как описано ранее, повторно суспендируйте клетки в буфере не более 500 микролитров и нанесите клеточную суспензию на подготовленную колонку LS. Промойте три раза с максимальным буфером в три миллилитра на колонку. Соберите общий приток немеченой фракции cd 1 33 отрицательных клеток.

Затем выбросьте фильтр разделения pres. Снимите колонку с сепаратора и поместите ее на подходящую сборную трубку. Внесите максимум пять миллилитров буфера.

Немедленно промойте меченые CD 1 33 положительными клетками, сильно вдавливая поршень в колонку для повышения чистоты отрицательной фракции. Нанесите суспензию ячейки на новую уравновешенную колонку LS и соберите отрицательную фракцию CD 1 33 в отходах. Этот резецированный метастаз в лимфатические узлы был получен от пациента с меланомой на поздней стадии.

После механической и ферментативной диссоциации ткани пеллеты отфильтрованных клеток содержали высокую контаминацию эритроцитами. Впоследствии, истощение эритроцитов, привело к образованию клеточной гранулы светло-коричневого цвета. Эти клетки культивировали в среде кванта 2 6 3, R-T-P-C-R меланоцитов и меланомы, фибробластов, дендритных и стволовых клеток.

Гены используются для подтверждения того, что клетки произошли из опухоли, а не из окружающей стромы. Взрослые меланоциты служили нормальными контрольными клетками для слезы, а клеточная линия эмбриональной карциномы N-C-C-I-T — положительным контролем для маркера стволовых клеток CD 1 33. Эти данные показывают, что некоторые первичные клетки действительно положительны на слезу и, следовательно, имеют меланоцитарное происхождение.

Культура также отрицательна на CD 83, маркер зрелых дендритных клеток. Интересно, что эта клеточная линия меланомы экспрессирует CD 1 33, ген, имеющий решающее значение для асимметричного деления клеток, и известный маркер раковых стволовых клеток. Здесь показана светлопольная микрофотография первичной клеточной культуры, сильно загрязненной фибробластами после лечения истощения фибробластов, культуры представляют собой первичные клетки меланомы.

Клетки первичной меланомы были отсортированы на CD 1 33 положительные и CD 1 33 отрицательные клетки. Эти данные иммунофлуоресцентного анализа, окрашивания и вестерн-блоттинга указывают на высокую эффективность и чистоту сортировки. Этот подход имеет большое значение для персонализированной медицины, потому что теперь мы можем использовать ткани и клетки, полученные от пациента, чтобы лучше прогнозировать реакцию на лекарства каждого пациента в отдельности.

Этот метод поможет нам ответить на ключевые вопросы, например, откуда происходит опухоль? Как лечить пациентов? И это поможет лучше переосмыслить подходы системной биологии путем проверки их экспериментов.