Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

В данном эксперименте используется проточная цитометрия для обнаружения и количественного определения ядерных белков в изолированных и иммуномаркированных ядрах нейтрофилов, выделенных из периферической крови человека. Эритроциты удаляют с помощью декстрина с последующим центрифугированием плазмы в градиенте плотности. Затем, используя антирецепторные антитела, стимулируют очищенные нейтрофилы через интегрины или FC-рецепторы.

Перейдите к выделению ядер и фиксации образцов для иммуномаркировки специфическими антителами к интересующему ядерному фактору NU. Например, NF kappa B, затем проанализируйте ядра с помощью проточной цитометрии, чтобы обнаружить незначительные изменения в активации ядерного фактора. Полученные результаты показывают, что стимуляция нейтрофилов через их интегрины приводит к увеличению ядерной концентрации транскрипционного фактора N of kappa B. Сигнальные пути, ведущие к активации ядерного фактора, обычно изучают с помощью репортерного анализа или метода анализа сдвига электрофоретической подвижности в первичных клетках.

Зачастую эти методы оказываются неприменимыми. Проточная цитометрия обеспечивает быстрое обнаружение и количественное определение ядерных белков в изолированных ядрах. Используйте 10 мл свежесобранной крови здоровых взрослых добровольцев.

Пипеткой перенесите 2 мл 6% раствора декстрина T 500 в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Затем добавьте 10 мл крови, перемешайте содержимое, перевернув пробирку два или три раза, и оставьте на 45 минут для седиментации эритроцитов под действием силы тяжести в новой конической центрифужной пробирке объемом 15 мл. Перенесите 5 мл в флакон FI fial pack.

Соберите плазму, обогащенную лейкоцитами, которая образовалась над осажденными эритроцитами. Осторожно нанесите ее слоем поверх фиколл-пака для создания двух фаз, центрифугируйте при 516 Gs в течение 20 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Удалите супернатант и разбейте клеточный осадок, постукивая пробиркой о штатив.

Затем ресуспендируйте клетки в 10 milliliters холодного PBS. Перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 50 milliliters и центрифугируйте при 290 Gs в течение пяти минут при температуре четыре degrees Celsius. Разбейте осадок клеток, как и ранее, и добавьте 10 milliliters холодного гипотонического раствора для лизиса эритроцитов.

Смешайте содержимое, осторожно вращая пробирку в течение ровно одной минуты. Затем добавьте 10 milliliters холодного гипертонического раствора и поместите на лед. После этого подсчитайте количество клеток, осадив нейтрофилы путем центрифугирования.

Мы суспендируем PMN в концентрации 10⁷ клеток на мл. Храните клетки на льду в холодном PBS. Перенесите по 100 µL суспензии PMN в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл.

Затем добавьте соответствующее моноклональное антитело в концентрации 10 micrograms per milliliter и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Для промывки клеток добавьте один milliliter холодного PBS, центрифугируйте и аспирируйте супернатант. Затем аккуратно ресуспендируйте осадок клеток и промойте их PBS еще дважды.

Для удаления несвязавшихся антител ресуспендируйте промытые PMN в том же исходном объеме теплого PBS, содержащего 60 µg/mL goat anti-mouse IgG, и инкубируйте при 37 °C от 1 до 20 минут в зависимости от исследуемого ядерного фактора. Затем добавьте 1 mL холодного PBS. После осаждения клеток путем центрифугирования удалите супернатант и немедленно заморозьте осадки клеток в смеси сухого льда с этанолом. Для каждого образца извлеките пробирку из смеси сухого льда с этанолом, протрите насухо и ресуспендируйте.

Ресуспендируйте замороженные осадки ПМН в 100 µL холодного гипотонического раствора. Поместите все образцы на лед, чтобы контролировать целостность ядер. Окрасьте аликвоту суспензии ядер трипановым синим.

Если суспензия ядер содержит много целых клеток или клеточного детрита, рекомендуется утилизировать препарат и начать процедуру с другим образцом. После осаждения ядер путем центрифугирования очень осторожно удалите супернатант, затем зафиксируйте ядра в 100 µL холодного 4% раствора параформальдегида и инкубируйте ядра на льду. После повторного осаждения ядер осторожно удалите супернатант, добавьте 100 µL холодного пермеационного буфера и инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут.

Затем соберите ядра путем центрифугирования. На этом этапе осадки ядер плохо прикрепляются к дну пробирки, поэтому рекомендуется провести повторное центрифугирование.

Если осадок разрыхлился. Для блокирования сайтов неспецифического связывания мы суспендируем ядра в 500 µL холодного 4% раствора фетальной бычьей сыворотки в PBS и инкубируем на льду в течение 20 минут. Осаждаем ядра путем центрифугирования, затем ресуспендируем ядра в 100 µL холодного PBS, содержащего 4% FBS и 2.5 µg/mL моноклональных антител к интересующему ядерному фактору. Инкубируем образцы на льду в течение 20 минут. После двукратной промывки образцов 500 µL холодного PBS с 4% FBS мы суспендируем ядра в 100 µL холодного PBS, содержащего 4% FBS и 10 µg/mL соответствующего вторичного антитела, меченого FITC; инкубируем на льду в течение 20 минут. После двух промывок ресуспендируем ядра в 400 µL холодного 4% раствора паральдегида в PBS.

Проанализируйте иммуномаркированные ядра на проточном цитометре, таком как FACScan или аналогичном аппарате. Настройте параметры сбора данных: FSC в логарифмическом масштабе на 10⁻¹, SSC в логарифмическом масштабе на 196, и выделите популяцию ядер с помощью гейтирования на диаграмме рассеяния. Соберите данные по 10 000 ядер для каждого образца.

Затем проанализируйте флуоресценцию ядер, окрашенных красителем fitsy, по одному каналу FL в логарифмическом масштабе при значении 400. Этот метод очистки PMN обычно позволяет получить нестимулированные нейтрофилы с чистотой более 95%; при этом ядра PMN выделяются с высоким выходом. Выделенные ядра легко распознаются как отдельная популяция, отличная от интактных PMN, при анализе на проточном цитометре с помощью точечной диаграммы после стимуляции. При кросс-линкинге бета-1-интегринов происходит транслокация NF kappa B в ядро, и это увеличение содержания ядерного NF kappa B регистрируется как рост интенсивности флуоресценции.

Аналогичным образом, стимуляция PMN посредством кросс-линкинга бета-2-интегринов также вызывает активацию NF kappa B, о чем свидетельствует увеличение флуоресценции. Чувствительность данного метода позволяет обнаруживать небольшие изменения уровней ядерного фактора; так, бета-1-интегрины, которые связывают белки внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, индуцируют более сильную активацию NF kappa B, чем бета-2-интегрины, связывающиеся с молекулами адгезии на других клетках. Данный метод обладает высокой гибкостью, поскольку позволяет использовать множество различных флуорохромов и проводить выделение ядер из различных типов клеток. Этот простой и экономичный подход может быть использован в исследованиях передачи сигнала, связанных с изменением уровней белков в ядрах различных типов клеток.