Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

В этом эксперименте используется проточная цитометрия для обнаружения и количественного определения ядерных белков в изолированных и иммуномеченых ядрах нейтрофилов для очистки нейтрофилов из периферической крови человека. Удалите эритроциты с помощью декстрина с последующим центрифугированием плазмы с градиентом плотности. Затем с помощью антирецепторных антител стимулируйте очищенные нейтрофилы с помощью интегринов или ФК-рецепторов.

Приступайте к выделению ядер и фиксации образцов для иммуномечения специфическими антителами против представляющего интерес ядерного фактора НУ. Например, NF kappa B в конечном итоге анализирует ядра с помощью проточной цитометрии, чтобы обнаружить небольшие изменения в активации ядерного фактора. Получены результаты, свидетельствующие о том, что стимуляция нейтрофилов через их интегрины приводит к увеличению ядерной концентрации транскрипционного фактора N каппы B. Сигнальные пути, которые приводят к активации ядерного фактора, обычно изучаются с помощью анализов репортерных генов или с помощью электрофоретических анализов сдвига подвижности в первичных клетках.

Часто эти способы не подходят. Проточная цитометрия обеспечивает быстрое обнаружение и количественное определение ядерных белков в изолированных ядрах. Начните с 10 миллилитров свежесобранной крови здоровых взрослых добровольцев.

Пипеткой нанесите два миллилитра 6%-ного раствора декстрина Т 500 в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Затем добавьте 10 миллилитров крови, перемешанной путем переворачивания пробирки два или три раза, и дайте 45 минут для осаждения эритроцитов под действием силы тяжести в свежей конической центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров. Поместите в нее пять миллилитров фиалочной упаковки FI.

Соберите богатую лейкоцитами плазму, которая образовалась над осажденными эритроцитами. Аккуратно выложите его поверх упаковки флайола, чтобы сформировать две фазы, центрифугируйте при температуре 516 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и разбейте клеточную гранулу, постучав трубкой по штативу.

Затем повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах холодной PBS. Перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при давлении 290 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Разбейте клеточную гранулу, как и раньше, и добавьте 10 миллилитров холодного гипотонического раствора в эритроциты щелочи.

Перемешивайте, аккуратно вращая тюбик ровно одну минуту. Далее добавьте 10 миллилитров холодного гипертонического раствора и храните на льду. Теперь перечислите клетки после гранулирования нейтрофилов центрифугированием.

Суспендируем ПМН в соотношении от 10 до семи ячеек на миллилитр. В холодном ПБС держат клетки на льду. Аликвоту 100 микролитров суспензии ПМН в 1,5 миллилитровые эйноровые пробирки.

Затем добавьте соответствующее моноклональное антитело в дозе 10 мкг на миллилитр и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Чтобы промыть клетки, добавьте один миллилитр холодной центрифуги PBS и аспирируйте надосадочную жидкость. Затем аккуратно разбейте ячейку и промойте еще два раза PBS.

Чтобы удалить несвязанные антитела, повторно суспендируйте промытый PMN в том же исходном объеме теплого PBS, содержащем 60 микрограммов на миллилитр Go antimuse IgG инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение от одной до 20 минут в зависимости от интересующего ядерного фактора. Теперь добавьте один миллилитр холодного PBS После гранулирования клеток методом центрифугирования удалите снат и заморозьте гранулы клеток сразу же в ванне с сухим льдом и этанолом. Для каждого образца извлеките пробирку из сухого льда, установите этанол для ванны, протрите начисто и восстановите.

Замороженные гранулы ПМН суспензировать в 100 микролитрах холодного гипотонического раствора. Поместите все образцы на лед, чтобы контролировать целостность ядер. Покрасьте Eloqua из суспензии ядер триановым синим.

Если ядра суспензии содержат много неповрежденных клеток или мусора, лучше отказаться от препарата и начать процедуру с другого образца. После гранулирования ядер методом центрифугирования удалите надосадочную жидкость очень осторожно, затем закрепите ядра на 100 мкл холодного, 4%-ного раствора параформы альдегида и инкубируйте ядра на льду. После гранулирования ядер осторожно извлеките из них 100 микролитров холодного проникающего буфера и инкубируйте образцы на льду в течение 10 минут.

Затем соберите ядра пермы с помощью центрифугирования. На этом этапе гранулы ядер плохо прикрепляются на дне трубки. Рекомендуется снова центрировать будущее.

Если гранула расшатывается Чтобы блокировать неспецифические сайты связывания, мы суспендируем ядра в 500 микролитрах холодной, 4% фетальной бычьей сыворотки в PBS и инкубируем на льду в течение 20 минут. Гранулируйте ядра центрифугированием, затем ресуспендируйте ядра и 100 микролитров холодного PBS, содержащего 4% FBS и 2,5 микрограмма на миллилитр моноклонального антитела против представляющего интерес ядерного фактора. Инкубируют образцы на льду в течение 20 минут после двукратной промывки образцов 500 мкл холодного PBS с 4% FBS, суспензируют ядра в 100 мкл холодного PBS, содержащего 4% FBS и 10 мкг миллилитра соответствующего меченного FZ вторичного антитела, инкубируют на льду в течение 20 минут после двух промывок, повторно суспендируют ядра в 400 мкл холодного 4%-ного паральдегида в PBS.

Проанализируйте меченые иммуно ядра с помощью проточного цитометра, такого как сканирование фактов или аналогичное устройство. Отрегулируйте настройки сбора данных: два FSC в логарифмическом масштабе на 10 до отрицательного, SSC на логарифмическом масштабе на 196 и ядра вентильных элементов на графике усыновления. Получите 10 000 ядер в каждом образце.

Затем анализируйте флуоресценцию ядер окрашивания через один канал FL, установленный на логарифмической шкале при 400. Данный метод очистки ПМН обычно дает нестимулированные нейтрофилы с чистотой более 95% из ядер ПМН, выделенных с высоким выходом, выделенных в ядра, могут быть легко распознаны как отличная популяция от интактных ПМН в проточном цитометре с помощью точечного графика при стимуляции. При сшивании бета-1 интегринов NF каппа B транслируется в ядро, и это приращение ядерной NF каппа B обнаруживается как увеличение флуоресценции.

Аналогичным образом, стимуляция PMN путем сшивания бета-двух интегринов также индуцирует активацию NF kappa B, на что указывает увеличение флуоресценции. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения уровней ядерных факторов, о чем свидетельствует тот факт, что бета-1 интегрины, которые связываются с белками внеклеточного матрикса, такими как фибронектин, индуцируют более сильную активацию NF kappa B, чем бета-2 интегрины, которые связываются с молекулами адгезии на других клетках. Этот метод обладает большой гибкостью, поскольку можно использовать множество различных флуорохромов, а также поскольку он позволяет получать ядра из различных типов клеток, используется этот простой и экономичный подход для исследований сигнальной трансдукции, которые включают изменения уровней белка в ядрах различных типов клеток.