Техники обработки глаз имплантировали протез для сетчатки Локализованные Гистопатологический анализ

Общая цель данной процедуры заключается в улучшении оценки безопасности ретинального протеза. Для этого сначала поверхность оптимально зафиксированного энуклеированного глаза маркируют тканевыми красителями, чтобы обозначить положение имплантированного электрода. На втором этапе электродная матрица удаляется, а ткани глаза расчленяются на полоски.

Затем полоски стабилизируют в агаре, после чего заливают парафином. На заключительном этапе отмеченные исследуемые области срезают и переносят на предметные стекла для окрашивания. В конечном итоге состояние тканей в имплантированных областях, прилегающих к каждому электроду, можно оценить с помощью светлопольной и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основным преимуществом данного метода является возможность минимизации артефактов фиксации и расслоения при точном отслеживании областей ткани, прилегающих к электроду, в крупных образцах. Этот метод также может быть использован для оценки безопасности новых имплантатов при других заболеваниях глаз. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку сетчатка склонна к расслоению, а работа с образцами требует высокого уровня точности движений.

Визуальная демонстрация этого метода важна, поскольку маркировка и работа с хрупкой тканью требуют длительного обучения. До начала данного исследования глаза после имплантации супрахориоидального электродного массива обрабатывались с использованием неоптимальной методики, отмеченной звездочкой. На этом первом изображении представлен репрезентативный ортогональный срез через полость электродного массива.

Обратите внимание, что сетчатка отделена от внешних тканей глаза. Это особенно заметно под областью имплантации, на что указывает наконечник стрелки. Также следует отметить, что невозможно определить, какая часть сетчатки прилегала к каждому отдельному электроду матрицы.

При большем увеличении в слоях сетчатки видны многочисленные регулярные артефакты, связанные с высвобождением, на которые указывают наконечники стрелок, а также значительное отслоение торпедообразного слоя — отражающего слоя в кошачьем глазу. При дальнейшем увеличении можно заметить, что наружные сегменты фоторецепторов, а также пигментный эпителий, тем не менее, остаются неповрежденными; это позволяет предположить, что ранее наблюдаемые отслойки являются артефактами или побочными эффектами обработки, а не результатом травмы или патологии in vivo. Таким образом, для минимизации этих связанных с фиксацией артефактов и расслоения была внедрена следующая методика.

После нуклеации и фиксации глаз начните с извлечения имплантированного глазного яблока из этанола и осторожного обрезания излишков тканей, включая конъюнктиву и капсулу сухожилия. Обрежьте зрительный нерв до длины 2–3 мм. Электродная решетка видна сквозь полупрозрачную склеру.

Затем с помощью кисти с тонким ворсом осторожно нанесите на ткань гистологические красители, чтобы пометить электроды в соответствии с заранее определенным цветовым кодом. Следите за тем, чтобы не размазать краситель. Дополнительные метки красителем могут быть нанесены для обозначения интересующих областей или для облегчения совмещения срезов.

Здесь максимально стимулированные электроды помечены зеленым цветом. Остальные активные электроды помечены красным. Возвратные электроды большего диаметра окрашены в желтый цвет, а любые дополнительные направляющие или анатомические метки обозначены синим красителем.

После пяти минут воздушного высушивания верните глазное яблоко в 70% этанол для дегидратации красителя. Затем, обрезав излишки ткани глазного яблока контрольного глаза без имплантата, как было продемонстрировано, используйте восемь нейлоновых швов, установленных на этапе нуклеации и фиксации, чтобы выровнять контрольный и имплантированный глаза как зеркальную пару. Затем поместите силиконовый шаблон с теми же размерами, что и электродная матрица, на зеркально расположенный участок контрольного глаза, соответствующий месту нахождения матрицы в имплантированном глазу.

Затем промаркируйте контрольный глазбор по аналогии с предыдущим действием, чтобы для каждого места имплантации электрода имела соответствующая контрольная пара в анатомически сопоставимом расположении. Далее извлеките матрицу имплантатов из глаза, затем удалите переднюю часть глаза, включая роговицу, радужную оболочку и хрусталик. После этого удалите стекловидное тело из оставшейся глазной чаши.

Теперь рассеките имплантированный глаз на несколько полосок толщиной два миллиметра. Каждая полоска должна содержать часть областей, отмеченных на матрице. Ориентацию полосок следует выбрать таким образом, чтобы облегчить оценку различных аспектов тканевой реакции на имплантат; тщательно задокументируйте положение меток матрицы на образцах для последующего использования.

Затем поместите полоску стороной, которую необходимо обрезать первой, вниз в неглубокий слой расплавленного агара. После застывания агара вырежьте образец и поместите его в тканевую кассету, используя пенопластовые вставки для поддержки. После препарирования и заливки контрольного глаза поместите кассеты в нейтральный буферный формалин и проведите их обработку в течение ночи с помощью стандартного автоматизированного 12-часового метода заливки парафином.

На следующий день залийте обработанную ткань парафином, расположив ее стороной, которая будет срезаться первой, вниз. Затем нарежьте парафиновые блоки на срезы толщиной пять микрон. После этого перенесите срезы из каждой окрашенной области на предметные стекла.

Для поиска области DY регулярно проверяйте предметные стекла под микроскопом. Области, непосредственно прилегающие к каждому окрашенному пятну склеры, будут теми, которые находились в наибольшей близости к соответствующему электроду матрицы. В завершение окрасьте срезы по своему усмотрению.

Высокий динамический диапазон. Представлены макрофотографии энуклеированного глаза кошки с установленным супрахориоидальным электродным массивом in situ после фиксации в фиксаторе Дэвидсона и до удаления массива. Полупрозрачная склера позволяет визуализировать отдельные электроды в массиве.

Как показано стрелкой, электроды маркированы заранее определенной цветовой схемой красителей. Эти метки красителем, нанесенные с регулярным интервалом от анатомических ориентиров, используются для обеспечения единообразия между экспериментами. После извлечения электродной матрицы глаз вручную рассекают на полоски образцов.

Наконечники стрелок указывают на два из участков склеры, прилегающих к электродам. Пунктирная линия обозначает плоскость сечения на данном репрезентативном срезе, полученном при разрезании образца с предыдущего рисунка; при этом общая форма полоски образца была сохранена с минимальными дифференциальными артефактами тканей. Обе метки красителем все еще видны на склере, на что указывают наконечники стрелок.

Хотя зеленый краситель оказался более устойчивым, чем красный, его локализация указывает на положение электрода. Таким образом, можно оценить состояние прилегающей ткани сетчатки на предмет повреждений, если таковые имеются, вызванных электрической стимуляцией; при данном увеличении видно, что слои сетчатки, прилегающие к зеленому красителю на предыдущем изображении, фактически не были отслоены, и морфология сетчатки здесь сохранилась. На этом первом изображении представлены репрезентативные результаты специального окрашивания и иммуногистохимического анализа срезов ткани сетчатки, обработанных в соответствии с данным протоколом.

Гематин окрасил ядра клеток в синий цвет, в то время как эозин окрасил цитоплазму клеток, коллаген и вспомогательную ткань в различные оттенки розового. На данном изображении люксал фаст блю окрасил миелин в синий цвет. Контрастное окрашивание крестальным фиолетовым использовалось для идентификации ганглионарных клеток путем окрашивания тел нейронов в синий цвет и выделения окружающих их сателлитных клеток. В данном срезе, обработанном по методу Мейсона (трион синий), раствор БРИК Скарлет кислый фуксин окрасил мышечные волокна в красный цвет, а лин синий окрасил коллаген.

В данном случае склера на этом срезе, окрашенном периодической кислотой по Шиффу, окрашена в синий цвет; гликопротеиновые компоненты базальной мембраны и компоненты соединительной ткани выглядят пурпурными, в то время как ядра клеток, докрашенные гематоксилином, выглядят синими. Срез субсклеральной области, представленный на этом изображении, был обработан реактивом Перлса (берлинская лазурь) в месте кровоизлияния. Образование гемосидерина из распавшихся эритроцитов и высвобождение комплексов железа привели к появлению пурпурного цвета.

Добавление нейтрального красного окрасило лизосомы в красный цвет на данном изображении; антитела к глутаминсинтетазе были окрашены в зеленый. Этот фермент, расщепляющий нейромедиатор и обнаруживаемый в клетках Мюллера, простирается в обоих направлениях: от тел клеток Мюллера во внутреннем ядерном слое до отростков клеток Мюллера, формирующих внутреннюю пограничную мембрану. Для окрашивания белка нейрофиламента этот цитоскелетный белок тяжелой цепи был помечен зеленым цветом; он обнаруживается в соме и отростках клеток. Белок нейрофиламента образует поперечные связи с другими нейрофиламентами для поддержания структуры нейронов.

Ганглионарные клетки и их аксоны наблюдаются в слоях ганглионарных клеток и нервных волокон, в то время как аксоны горизонтальных клеток, расположенных на внешней границе внутреннего ядерного слоя сетчатки кошки, окрашены в зеленый цвет. На этом заключительном изображении показан глиальный фибриллярный кислый белок — этот цитоскелетный белок, окрашенный в красный цвет, пролиферирует в клетках Мюллера и астроцитах при глиозе; его можно увидеть вдоль слоя нервных волокон, где клетки Мюллера образуют тонкие отростки, проходящие от внутренних к внешним слоям сетчатки. Контрастирование с помощью DPI синего цвета позволяет визуализировать слои сетчатки.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости визуализации рабочего процесса с образцом в трех измерениях и регулярно учитывать ориентацию образцов на протяжении всего процесса. После выполнения этой процедуры можно использовать любые гистологические методы для получения дополнительных ответов на вопросы, касающиеся безопасности после разработки. Этот метод позволил исследователям, занимающимся созданием бионического глаза, оценить уровни безопасной стимуляции при длительном применении у слепых пациентов.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как оценивать безопасность имплантата бионического глаза.