Техники обработки глаз имплантировали протез для сетчатки Локализованные Гистопатологический анализ

Общей целью этой процедуры является улучшение оценки безопасности протеза сетчатки. Это достигается путем предварительной маркировки поверхности оптимально зафиксированного энуклеированного глаза тканевыми красителями, чтобы указать положение имплантированного электрода. На втором этапе электродная решетка удаляется, а ткань глаза рассекается на полоски.

Далее полоски стабилизируются в агаре и затем погружаются в парафин. На заключительном этапе отмеченные области интереса разрезаются и собираются на предметных стеклах для окрашивания. В конечном счете, состояние имплантированных областей, прилегающих к каждому электроду, может быть оценено с помощью светлопольной и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что артефакты и расслоения, связанные с фиксацией, могут быть сведены к минимуму, в то время как прилегающие к электроду участки тканей могут быть точно отслежены в больших образцах. Он также может быть использован для оценки безопасности новых имплантатов при других глазных заболеваниях. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, найдут его сложным, потому что сетчатка склонна к расслоению, и для работы с образцами требуется высокий уровень ловкости.

Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что маркировке и работе с хрупкими тканями трудно научиться. До этого исследования, после имплантации с помощью супрахориоидальной электродной решетки, глаза предварительно обрабатывались с использованием неоптимальной методики, на что указывает звезда. На этом первом изображении показан репрезентативный ортогональный разрез через полость электродной решетки.

Обратите внимание, что сетчатка отделена от наружной ткани глаза. Это особенно заметно под имплантированной областью, на что указывает наконечник стрелы. Заметим также, что невозможно определить, какая часть сетчатки примыкала к каждому отдельному электроду решетки.

При таком большем увеличении в слоях сетчатки есть несколько артефактов, основанных на регулярном высвобождении, на что указывают наконечники стрел, а также значительное отслоение от слоя торпеды, отражающего слоя в кошачьем глазу. При дальнейшем увеличении можно наблюдать, что внешние сегменты фоторецепторов, а также пигментированный эпителий, тем не менее, остаются неповрежденными, что позволяет предположить, что ранее наблюдавшиеся отслойки или артефактные побочные эффекты процессинга являются результатом травмы или патологии in vivo. Таким образом, была реализована следующая методика для минимизации артефактов, связанных с фиксацией и расслоением.

После зарождения и фиксации глаз начинают с удаления имплантированного глазного шара из этанола и тщательной обрезки лишней ткани, включая конъюнктиву и капсулу сухожилия. Обрежьте зрительный нерв до длины в два-три миллиметра. Электродная решетка видна через полупрозрачную склеру.

Затем с помощью кисти с тонким концом осторожно нанесите гистологические красители на ткань, чтобы пометить электроды заранее определенным цветовым кодом. Следите за тем, чтобы не размазать краску. Дополнительная маркировка красителем может быть сделана для определения точек интереса или для выравнивания секций.

Здесь максимально стимулированные электроды помечены зеленым цветом. Другие активные электроды помечены красным цветом. Обратные электроды большего диаметра были окрашены в желтый цвет, а любые дополнительные направляющие или анатомические маркировки были помечены синим красителем.

После пяти минут сушки на воздухе верните шар к 70% этанолу, чтобы обезвожить краситель. Затем, после обрезки лишней ткани с непосаженного контрольного глазного яблока, как показано выше, используйте восемь нейлоновых швов, прикрепленных на этапе зарождения и фиксации, чтобы выровнять контрольный и имплантированный глаза как зеркальную пару. Затем поместите силиконовый шаблон с теми же размерами, что и электродная решетка, на зеркальное место на контрольной панели I, соответствующее расположению решетки в имплантированном глазу.

Затем пометьте контрольный глобус как только что показанный, чтобы у каждого имплантированного электрода была контрольная пара в анатомически сопоставимом месте. Затем извлеките массив имплантатов из глаза, а затем удалите переднюю часть глаза, включая роговицу, радужную оболочку и хрусталик. Далее удалите стекловидное тело из оставшегося наглазника.

Теперь рассеките имплантированный глаз на несколько полосок толщиной в два миллиметра. Каждая из них содержит подмножество областей, помеченных кристаллом. Ориентация полосок должна быть выбрана таким образом, чтобы помочь в оценке различных аспектов реакции тканей на имплантат, тщательно задокументировать положение маркировки штампа на образцах для использования в будущем.

Затем поместите полосу стороной, которую нужно разрезать, сначала лицевой стороной вниз в неглубокую лужу сжиженного агара. После того, как агар схватится, разрежьте образец вокруг и поместите его в тканевую кассету, поддерживаемую вставками из пенопласта. После препарирования и встраивания контрольного глаза поместите кассеты в нейтральный буферный формин и обрабатывайте их в течение ночи с помощью стандартной автоматизированной 12-часовой технологии обработки парафина.

На следующий день заделайте обработанную ткань в парафин стороной, которую нужно разрезать первой, вниз. Теперь разрежьте парафиновые блоки на секции по пять микрон. Затем закрепите секции из каждой из окрашенных областей на предметных стеклах.

Для того, чтобы локализовать область DY, регулярно проверяйте предметные стекла под микроскопом. Области, непосредственно прилегающие к каждому окрашенному пятну склеры, будут теми, которые находились в непосредственной близости от соответствующего электрода от решетки. Наконец, окрасьте участки по желанию.

Высокий динамический диапазон. Макрофотографии энуклеированного кошачьего глаза с супрахориоидальной электродной решеткой in situ показаны после фиксации фиксатором Дэвидсона и до удаления решетки. Полупрозрачная склера позволяет визуализировать отдельные электроды в массиве.

Как указано стрелкой, электроды помечены предопределенной цветовой схемой красителя. Эти маркировки красителями, размещенные с равным расстоянием от анатомических ориентиров, используются для поддержания согласованности между экспериментами. После удаления электродной решетки глаз вручную рассекается на полоски для образцов.

Стрелки указывают на два смежных участка электродов на склере. Пунктирной линией обозначена плоскость разреза в этом репрезентативном сечении, полученная при разрезании образца по предыдущему рисунку, общая форма полоски образца была сохранена с минимальными дифференциальными тканевыми артефактами. Оба отметины красителя все еще видны на склерах, на что указывают наконечники стрелок.

Хотя зеленый краситель был более упругим, чем красный, расположение красителя указывает на положение электрода. Таким образом, прилегающая ткань сетчатки может быть оценена на предмет повреждений, если таковые имеются, вызванных электрической стимуляцией, поскольку при этом увеличении слои сетчатки, прилегающие к зеленому красителю, видимому на предыдущем изображении, фактически не были отделены, и морфология сетчатки здесь сохранилась. На этом первом изображении показано репрезентативное специальное окрашивание и иммуногистохимия срезов ткани сетчатки, обработанных в соответствии с текущим протоколом.

Гематин окрашивал ядра клеток в синий цвет, в то время как эоин окрашивал цитоплазму клетки, коллаген и поддерживающие ткани, различные оттенки розового На этом изображении роскошный быстрый синий окрашивал миелин в синий. Для идентификации ганглиозных клеток было использовано противофиолетовое окрашивание путем окрашивания тел ракет в перикальный синий цвет и выделения окружающих сателлитных клеток. В этом сечении, обработанном трионовым синим, раствор BRIC Scarlet для слияния кислот окрашивал мышечные волокна в красный цвет, в то время как синий цвет окрашивал коллаген.

В этом случае склеры синего цвета для этого участка, окрашенного периодической кислотой, гликопротеиновые компоненты базальной мембраны и компоненты соединительной ткани выглядят фиолетовыми, в то время как ядра клеток гемата и противостойного окрашивания кажутся синими. Субсклеральный разрез, показанный на этом снимке, был обработан жемчужным прусским синим в месте кровоизлияния. Образование гемосидерина из разрушенных эритроцитов и высвобождение комплексов железа приводило к фиолетовому цвету.

Добавление нейтрального красного окрашивало лизосомы в красный цвет на этом изображении, антиглутаминовый синтез был окрашен. Этот фермент, разрушающий нейротрансмиттеры, обнаруженный в клетках Мюллера зеленым цветом, распространяется в обоих направлениях с телами клеток Мюллера внутри внутреннего ядерного слоя и концом клетки Мюллера, образуя внутреннюю пограничную мембрану для окрашивания белка нейрофиламента. Этот белок цитоскелета с тяжелой цепью был помечен зеленым цветом, обнаружен в клетке сомы и обрабатывает перекрестные связи белка нейрофиламента с другими нейрофиламентами для поддержания структуры нейронов.

Ганглиозные клетки и их аксоны можно наблюдать в слоях ганглиозных клеток и нервных волокон, в то время как аксоны горизонтальных клеток, расположенные на внешней границе внутреннего ядерного слоя в сетчатке кошек, выглядят зелеными. На этом окончательном изображении глиальный фибриллярный кислый белок показан красным цветом, этот цитоскелетный белок пролиферирует в клетках Мюллера и астроцитах во время глиоза и может быть замечен выстилающим слой нервных волокон клетками Мюллера, образующими тонкие отростки через внутренние и внешние слои сетчатки. Встречное окрашивание с DPI синего цвета позволяет визуализировать слои сетчатки.

Выполняя эту процедуру, важно помнить о необходимости визуализировать рабочий процесс с образцами в трех измерениях и регулярно учитывать ориентацию образцов на протяжении всей процедуры. После этой процедуры все гистологические методы могут быть использованы для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с безопасностью после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области разработки бионических глаз для оценки безопасных уровней стимуляции в долгосрочной перспективе для слепых пациентов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценить безопасность бионического глазного имплантата.