Методы обработки глаз имплантировали сетчатки протезирования для локализованных гистопатологического анализа: Часть 2 Epiretinal Имплантаты с сетчатки гвозди

Ретинальные протезы с жесткими металлическими компонентами несовместимы с традиционными гистологическими методами обработки. Здесь мы описываем методы оценки состояния тканей глаза непосредственно рядом с ретинальным имплантатом, закрепленным эпиретинально с помощью металлической Т-образной опоры. Это достигается путем первоначального нуклеирования и фиксации глаза согласно протоколу, описанному в сопутствующем видео, с последующим выделением образца ткани, включающего имплантат и Т-образную опору сетчатки. На втором этапе проводится постепенная дегидратация образца ткани с его последующей заливкой в эпоксидную смолу в нужном направлении с использованием двухэтапного процесса заливки. Затем окончательный блок смолы помещают в специальный держатель и постепенно шлифуют до тех пор, пока на нужном уровне не будет обнажен поперечный срез через имплантат и окружающие ткани глаза.

Заключительный этап заключается в поверхностном окрашивании открытой ткани с последующим получением изображений и фотографированием с помощью диссекционного микроскопа с большим увеличением для визуализации клеточной архитектуры, прилегающей к имплантированному протезу. Эти действия повторяются несколько раз по мере необходимости. В конечном итоге собирается серия поперечных срезов образца ткани, включая имплантат in situ, которые могут быть использованы для доработки конструкции устройства или метода операции, а также для оценки безопасности конкретного протеза.

Главным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как традиционная гистологическая резка лезвием, является то, что имплантированные в сердце объекты, включая металлические компоненты, могут оставаться in situ во время процедуры, что позволяет визуализировать интерфейс между имплантатом и тканью. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области ретинального протезирования, например, оценить структурную целостность нежных тканей глаза, прилегающих к имплантированному ретинальному протезу. После энуклеации глаза и фиксации, описанных в сопутствующем видео JoVE, визуализируйте имплантат и точку его крепления к внешней стороне глаза.

Используя лезвие под углом 15 градусов, сделайте циркулярный транскернеальный разрез и удалите роговичный колпачок, чтобы открыть внутреннюю часть глазного яблока. Обратите внимание, что хрусталик был удален ранее в ходе лензэктомии и витрэктомии, которые являются частью хирургической процедуры по установке данного эпиретинального имплантата.

Затем выполните диссекцию, отодвиньте радужку и любые остаточные волокна Цонса хрусталика, чтобы обнажить заднюю камеру с эпиретинальным имплантатом и металлическим Т-образным элементом in situ. В зависимости от типа имплантата и целей исследования удалите лишние компоненты перед дальнейшей диссекцией. В данном примере оцениваемая эпиретинальная матрица представляет собой прототип герметичного блока с алмазным электродом и электроникой, размещенный в конформном силиконовом носителе.

Осторожно вырежьте образец, включающий закрепляющий элемент и окружающие ткани, в нужном направлении. С помощью тонких диссекционных ножниц вырежьте полоски полной толщины из заднего отдела глаза, включая склеру, хориоидею и сетчатку. Затем аккуратно извлеките блок с алмазным электродом, используя скальпель для тонкой диссекции.

Оставьте силиконовый корпус имплантата вместе с ретинальной скрепкой и остатками платиновых проводов. Возьмите образец, представляющий собой продольный срез скрепки, на котором видны все слои сетчатки, прилегающие к скрепке. Затем поместите образец обратно в 70% Ethanol.

Проведите обезвоживание образца в течение трех дней, используя серию возрастающих концентраций этанола. Сначала обезводьте образец в 70% ethanol дважды по два часа. Затем обезводьте образец в 80% ethanol дважды по два часа, после чего на следующий день оставьте образец в 90% Ethanol на ночь, затем проведите обезвоживание дважды по два часа. Далее обезводьте образец в 100% ethanol дважды по два часа, после чего оставьте его на ночь.

Наконец, проведите обезвоживание образца в 100% ацетоне дважды по два часа. Извлеките образец из ацетона и наблюдайте за ним под световым микроскопом в процессе высыхания на воздухе при комнатной температуре. Удаление жидкости из мягких тканей приводит к коллапсу клеток и усадке.

Образец переносят в эпоксидную смолу непосредственно перед тем, как он начнет скручиваться и деформироваться. Навык определения момента начала скручивания и коллапса ткани приобретается с опытом. Чтобы заключить образец в прозрачную эпоксидную смолу, погрузите ткань глаза в расплавленную эпоксидную смолу в подходящем герметичном контейнере.

Осторожно удалите пузырьки воздуха из эпоксидной смолы в вакуумной камере и оставьте ее при комнатной температуре на ночь для отверждения. Чтобы образец был расположен в нужном направлении, обрежьте отвержденную смолу с образцом с помощью ленточной пилы и шлифовального станка. Поместите обрезанный блок с тканью глаза в свежую разжиженную эпоксидную смолу так, чтобы длинная ось образца была ориентирована параллельно дну формы. Используйте каплю суперклея, чтобы закрепить обрезанный образец на дне держателя.

Заполните держатель образца жидкой эпоксидной смолой, удалите пузырьки воздуха, как описано ранее, и оставьте для отверждения на ночь. Затем закрепите смолу в держателе для шлифовки образцов и вручную отшлифуйте образец при 230–250 об/мин при подаче воды, используя бумагу с карбидом кремния. Для окрашивания погрузите шлифованную поверхность в краситель Toluidine Blue на три–пять минут или до появления окраски.

После промывки образца водопроводной водой сфотографируйте шлифованную поверхность образца с помощью стереомикроскопа с большим увеличением. Чтобы визуализировать клеточные слои сетчатки, нанесите каплю дистиллированной воды на верхнюю поверхность эпоксидной смолы непосредственно над образцом, чтобы сгладить дифракцию на границе раздела воздуха и эпоксидной смолы.

Для освещения образца используйте источник света с оптоволоконным гибким световодом. Повторяйте этапы шлифовки и получения изображений, каждый раз снимая заданный слой материала образца. Минимальный точный и воспроизводимый шаг шлифовки держателя образцов составляет 20 microns.

Этот процесс повторяется постепенно до тех пор, пока на желаемом уровне не будет обнажен поперечный срез имплантата и окружающих тканей глаза. Здесь представлены примеры изображений тканей сетчатки, визуализированных в непосредственной близости от титановой ретинальной фиксационной скобы на различных этапах процесса шлифовки. На изображениях показаны продольные срезы скобы, проникающей через глаз и выходящей из склеры, примыкающей к окрашенной толуидиновым синим и неокрашенной сетчатке в силиконе.

Неартефактная отслойка и складчатость сетчатки наблюдаются по обе стороны от силикона как при малом, так и при большом увеличении. Видно, что стержень фиксатора погружен в силикон, а головка фиксатора пронзила сетчатку и склеру. Здесь очевидно наличие неартефактной отслойки неокрашенной сетчатки по обе стороны от силикона, что визуализируется как при малом, так и при большом увеличении.

На примере показано, что рядом с зажимом наблюдается дезорганизация сетчатки, а с одной стороны — компрессия сетчатки из-за косого угла введения. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного заливания, ориентации и триммирования образца, чтобы полученные шлифованные поверхности были выровнены в нужной плоскости. Кроме того, на каждом этапе шлифовки следует сделать несколько фотографий, так как восстановить шлифованные образцы в дальнейшем невозможно.

Данный метод позволяет детально изучить гистологию ретинальных протезов. Он также может быть применен для визуализации интерфейса между устройством и тканью в других системах, использующих жесткие имплантируемые компоненты, таких как глубокие имплантаты головного мозга, сосудистые стенты или ортопедические протезы.