Методы обработки глаз имплантировали сетчатки протезирования для локализованных гистопатологического анализа: Часть 2 Epiretinal Имплантаты с сетчатки гвозди

Протезы сетчатки с компонентами из твердых металлов не совместимы с традиционными гистологическими процессами. Здесь мы опишем методы оценки здоровья глаза, непосредственно примыкающего к имплантату сетчатки, закрепленному эпиретинально металлическим Т. Это достигается путем сначала зарождения и фиксации глаза в соответствии с протоколом, описанным в сопутствующем видео, а затем препарирования образца ткани, который включает в себя имплантат и Т сетчатки. Вторым шагом является постепенное обезвоживание образца ткани и последующее встраивание его в эпоксидную смолу в Желаемая ориентация с помощью двухэтапного процесса встраивания. Затем окончательный блок смолы устанавливается в специальный держатель и постепенно шлифуется до тех пор, пока поперечное сечение через имплантат и окружающие глазные ткани не обнажится на желаемом уровне.

Заключительным этапом является поверхностное окрашивание обнаженной ткани, а затем изображение и фотография с помощью мощного диссекционного микроскопа для визуализации клеточной архитектуры, прилегающей к имплантированному протезу. Затем эти шаги повторяются несколько раз по мере необходимости. В конечном счете, собирается серия изображений поперечного сечения образца ткани, включая имплантат in situ, и может быть использована для уточнения конструкции устройства или хирургического вмешательства, а также для помощи в оценке безопасности конкретного протеза.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как традиционная гистология резки на основе лезвия, заключается в том, что имплантаты сердца, включая металлические компоненты, могут оставаться на месте во время процедуры, что позволяет визуализировать границу раздела ткани имплантата. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области протезирования сетчатки, такие как оценка структурной целостности нежной глазной ткани, прилегающей к имплантированному протезу сетчатки. После энуклеации глаза и фиксации, как описано в сопутствующем видео JoVE, визуализируйте имплантат и точку, где он крепится к внешней стороне глаза.

С помощью лезвия под углом 15 градусов. Сделайте круговой транс-разрез роговицы и снимите колпачок роговицы, чтобы обнажить внутреннюю часть глазного яблока. Обратите внимание, что хрусталик ранее был удален во время линзэктомии витрэктомии, которая является частью хирургической процедуры для этого эпиретинального имплантата.

Затем очистите радужную оболочку и любые остаточные Z-волокна хрусталика, чтобы открыть заднюю камеру с эпиретинальным имплантатом и металлическим Т in situ. В зависимости от имплантата и проводимого исследования перед дальнейшим рассечением удаляют посторонние компоненты. В настоящем примере оцениваемая эпиретинальная решетка состоит из прототипа герметичного алмазного электрода и электронного корпуса, размещенного в конформном силиконовом носителе.

Тщательно препарируйте образец, который включает в себя клей и окружающие ткани в нужной ориентации. Используйте тонкие ножницы для препарирования, чтобы вырезать полоски на всю толщину с задней части глаза, включая склеру, сосудистую оболочку и сетчатку. Здесь осторожно извлекают пакет алмазных электродов путем тонкого рассечения скальпелем.

Оставьте силиконовый корпус имплантата вместе с липкой сетчаткой и остатками платиновой проводки. Возьмите образец, который дает продольное поперечное сечение прихватки, показывающее все слои сетчатки, прилегающие к прихватке. Затем верните образец до 70% этанола.

Обезвоживайте образец в течение трех дней на прогрессивных стадиях этанола. Сначала обезвоживайте образец в 70% этаноле в течение двух часов, два раза. Затем дважды обезвоживайте образец в 80% этаноле в течение двух часов, а затем в течение ночи на следующий день обезвоживайте образец в 90% этаноле в течение двух часов, дважды приступайте к обезвоживанию образца в 100% этаноле в течение двух часов, а затем в течение ночи.

Наконец, дважды обезвоживайте образец в 100% ацетоне в течение двух часов. Извлеките образец из ацетона и наблюдайте за ним под световым микроскопом, пока воздух высыхает при комнатной температуре. Удаление жидкости из мягких тканей приводит к коллапсу клеток и усадке.

Образец будет перенесен на эпоксидную смолу непосредственно перед тем, как она начнет скручиваться и сворачиваться. Понимание того, когда происходит скручивание и скручивание ткани, развивается с опытом. Чтобы поместить образец в прозрачную эпоксидную смолу, погрузите ткань глаза в разжиженную эпоксидную смолу в соответствующий герметичный контейнер.

Аккуратно дегазируйте эпоксидную смолу в вакуумной камере и оставьте на ночь при комнатной температуре для отверждения. Позаботьтесь о том, чтобы встроить образец в желаемую ориентацию, изменив размер отвержденной эпоксидной смолы и образца с помощью ленточной пилы и трости. Используйте пятно суперклея, чтобы закрепить образец изменения размера на дне держателя образца.

Заполните держатель образцов сжиженной эпоксидной смолой и, как и прежде, дегазируйте, оставьте для затвердевания на ночь. Затем установите смолу в держатель для шлифовальных образцов и вручную измельчите образец со скоростью от 230 до 250 об/мин с помощью бумаги из карбида кремния. Для окрашивания окуните поверхность земли в синий морилку на три-пять минут или пока не появится пятно.

После промывки образца водопроводной водой сфотографируйте поверхность грунта образца с помощью более мощного рассечения. Размах. Чтобы визуализировать клеточные слои сетчатки, нанесите каплю дистиллированной воды на верхнюю поверхность эпоксидной смолы прямо над образцом. Для сглаживания дифракции на границе раздела воздушной эпоксидной смолы.

Используйте оптоволоконный источник света на гусиной шее для освещения образца. Повторяйте шаги шлифовки и визуализации каждый раз, отшлифовывая образец заданной толщины. Минимальное точное и воспроизводимое приращение измельчения держателя образца составляет 20 микрон.

Этот процесс повторяется постепенно до тех пор, пока поперечное сечение через имплантат и окружающие ткани глаза не обнажится на желаемом уровне. Показывать. Вот примеры изображений ткани сетчатки, визуализированных непосредственно рядом с титановым Т-образным ретиналом в различных точках процесса шлифования. На изображениях видны продольные участки клейкости, проникающие через глаз и выходящие из склеры, примыкающие к окрашенной и неокрашенной сетчатке цвета силикона и толуидина синего цвета.

Неартефактная отслойка и складчатость сетчатки могут наблюдаться с обеих сторон силикона как при низкой, так и при высокой мощности. Видно, что стержень прихватки залит силиконом, а головка прихватки проникла в сетчатку глаза и склеру. Здесь очевидно, что существует неартефактное отслоение сетчатки в неокрашенной сетчатке по обе стороны от силикона, визуализируемого как при низкой, так и при высокой мощности.

Пример показал, что существует дезорганизация сетчатки рядом с прихваткой и сжатие сетчатки с одной стороны из-за косого угла введения. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что образец нужно тщательно встраивать, ориентировать и язычковать, чтобы полученные поверхности грунта были выровнены в нужном плане. Кроме того, на каждой стадии измельчения необходимо собирать несколько фотографий, так как образцы грунта сегодня не могут быть восстановлены.

Этот метод может дать представление о гистологии протезов сетчатки. Он также может быть применен для визуализации тканевого интерфейса устройства в других системах, в которых используются жестко имплантированные компоненты, такие как глубокие мозговые имплантаты, сосудистые стенты или ортопедические протезы.