Полное прижигание лимбального сосудистого сплетения при хирургически индуцированной глаукоме у грызунов

Целью данного протокола является характеристика новой модели глаукоматозной нейродегенерации, основанной на термическом прижигании лимбального сосудистого сплетения на 360°, индуцирующем подострую глазную гипертензию.

Мы разработали простой метод индуцирования устойчивой и прогрессирующей дегенерации глаукомы, основанный на временном повышении внутриглазного давления. Это уникальная возможность изучить ключевые моменты патофизиологии глаукомы. Это простая в освоении, неинвазивная, недорогая и высоковоспроизводимая модель, которая позволяет проводить функциональный анализ in vivo и краткосрочные экспериментальные проекты с использованием меньшего количества животных для каждого эксперимента.

Сетчатка и зрительный нерв являются оцениваемыми частями центральной нервной системы, поэтому моделирование прогрессирующего нарушения этих структур может дать ценную информацию о других нейродегенеративных заболеваниях. Чтобы измерить исходное внутриглазное давление (ВГД) как экспериментальных, так и контралатеральных контрольных глаз, поместите крысу под наркозом в положение вентрального пролежня на столешнице так, чтобы поверхность роговицы была легко доступна для кончика тонометра. Расположите наконечник тонометра так, чтобы он слегка касался центральной зоны роговицы перпендикулярно.

Затем выполните измерение, нажав кнопку измерения. Затем поместите крысу в слегка боковое пролежневое положение под стереомикроскопом и осмотрите экспериментальный глаз при 40-кратном увеличении. Во время процедуры контралатеральный контрольный глаз смазывают, закапывая каплю кармеллозы натрия или гиалуроната натрия.

Затем, используя изогнутые щипцы, осторожно протолкните экспериментальное глазное яблоко вперед, чтобы обнажить сосудистую сеть, окружающую лимб на 360 градусов. Затем другой рукой, используя низкотемпературное офтальмологическое прижигание, аккуратно прижгите сосуды по всему периметру роговицы. Будьте осторожны, чтобы не прижечь периферию роговицы.

Подтвердите успешность хирургического вмешательства, наблюдая появление небольших круглых следов прижигания на склеральном лимбе, облитерацию лимбальной сосудистой сети, расширение зрачка в прооперированном глазу. После операции проверьте послеоперационное ВГД обоих глаз, как было показано ранее. Затем нанесите каплю офтальмологического преднизолона ацетата на переднюю поверхность экспериментального глаза.

Через 40 секунд замените его офтальмологической мазью с антибиотиком. Применяйте ежедневное клиническое наблюдение за экспериментальным глазом с помощью местных препаратов, состоящих из нестероидного противовоспалительного препарата и мази с антибиотиком. Для анализа оптомоторного ответа поместите крысу для привыкания на платформу, состоящую из четырех компьютерных мониторов, расположенных в четырехугольнике.

Удерживайте курсор красного перекрестия на видеокадре между глазами свободно движущейся крысы, так как он указывает на центр виртуального цилиндра. Обратите внимание на оптомоторную реакцию, состоящую из рефлекторного отслеживания головы и шеи крысы, вызванной вращающимися градациями. Первоначально вводят стимул с низкой пространственной частотой, затем постепенно увеличивают частоту до тех пор, пока не будет замечено отслеживание движения.

Для записи электроретинограммы рисунка после обезболивания крысы осторожно вводят активный электрод на височную периферию роговицы. Дополнительно вводят электрод сравнения в подкожную клетчатку ипсилатерального височного кантуса, а заземляющий электрод – в одну из задних конечностей. Затем расположите крысу на расстоянии 20 сантиметров от экрана стимула, следите за базовой линией сигнала и начните сбор данных, нажав кнопку «Анализ» на системе сбора данных.

После изоляции сетчатки перенесите ее в 24-луночный культуральный планшет, содержащий один миллилитр PBS, держа внутреннюю сетчатку вверх. Пермеабилизацию ткани путем промывания 0,5%-ным неионогенным поверхностно-активным веществом, разбавленным в PBS. Затем инкубируйте ткань и блокирующий раствор в течение одного часа при комнатной температуре при легком встряхивании.

Во время инкубации приготовьте раствор первичных антител Brn-3a и храните при температуре четыре градуса Цельсия. После блокады тканей инкубируют сетчатку в 200 микролитрах раствора первичных антител при температуре четыре градуса Цельсия в течение 72 часов при легком встряхивании. Далее постирайте салфетку с ПБС.

Инкубируют ткань в 200 микролитрах раствора вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре, а затем с раствором ядерного контрокрашивания в течение 10 минут для флуоресцентного окрашивания ядер. После трех промывок PBS перенесите сетчатку на предметное стекло микроскопа с помощью двух маленьких щеток, придерживая стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметном стекле микроскопа.

Наконец, нанесите 200 микролитров антизатухающего монтажного средства на стеклянную защитную пленку и поместите ее на плоскую сетчатку для микроскопического анализа. Под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом, используя 40-кратное увеличение, исследуют плоские крепления, чтобы оценить ганглиозные клетки сетчатки. После энуклеации глазного яблока удаляют проксимальный сегмент внутриглазничного отдела зрительного нерва, включая часть внутриглазной части.

Затем сразу же поместите образцы во флаконы или пробирки, содержащие от 200 до 300 микролитров фиксатора холода. Через два часа промойте ткань холодным 100 микромолярным натриевым какодилатным буфером. Затем закрепите ткань в течение одного часа в 1%-ном тетраоксиде осмия и пяти наномолярных хлоридах кальция при температуре четыре градуса Цельсия при легком встряхивании.

После трех промывок холодным буфером какодилата натрия фрагменты зрительного нерва промывают холодной дистиллированной водой перед инкубацией в течение ночи и 1%-ным ацетатом писсуара при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день, после трех промываний водой, постепенно обезвоживайте ткань в возрастающей концентрации ацетона. Затем выполните три цикла заделки и растворов эпоксидной смолы ацетона, прежде чем погрузить ткань в чистую эпоксидную смолу на 24 часа.

На следующий день извлеките образцы из держателя образцов и перенесите их в формы для закладки на 48 часов при температуре 60 градусов Цельсия. После полимеризации с помощью ультрамикротома вырезают поперечные полутонкие срезы фрагментов зрительного нерва. Затем соберите и перенесите срезы на предметное стекло микроскопа.

Окрасьте срезы толуидиновым синим и визуализируйте их с помощью оптического микроскопа при 100-кратном увеличении. Для ультраструктурного анализа выполните ультратонкие поперечные сечения и соберите их на медную сетку. Затем окрасьте срезы ацетатом писсуара и цитратом свинца для просвечивающего электронно-микроскопического исследования.

Прижигание по всему кругу индуцировало повышение ВГД сразу после операции по сравнению с контрольными глазами. Пик послеоперационного ВГД наблюдался в первые сутки и постепенно снижался до исходного уровня на шестые сутки. Кроме того, функцию сетчатки оценивали как поведенчески, так и электрофизиологически с помощью оптомоторного рефлекса и паттерн-электроретинограммы соответственно.

После операции оба параметра показали две различные фазы нарушения: острая фаза глазной гипертензии на третий день и фаза вторичной дегенерации на 30-й день. По сравнению с контрольными зрительными нервами, количество аксонов и полутонких поперечных срезов зрительного нерва прогрессивно уменьшалось после операции. Просвечивающие электронные микрофотографии зрительных нервов контрольного глаза продемонстрировали плотно упакованные миелинизированные волокна, разделенные тонкими отростками глиальных клеток, и явные аксональные микротрубочки и нейрофиламенты.

Напротив, после трех дней глазной гипертензии наблюдалось несколько дегенеративных волокон, цитоплазматическая вакуолизация в глиальноклеточных отростках и конденсированный хроматин в ядрах глиальных клеток. Через семь дней наблюдалось увеличение дегенеративных аксональных волокон и гипертонических процессов глиальных клеток. А через 14 дней наблюдалась еще большая дезорганизация волокон зрительного нерва, связанная с инвазией глиальных клеточных отростков среди аксонов.

Кроме того, плотность ганглиозных клеток сетчатки со временем уменьшалась, в основном в дорсальном и височном квадрантах сетчатки. Выполняя эту процедуру, старайтесь осторожно прикасаться к лимбальным сосудам кончиком прижигателя, щадя периферию спинного мозга и следя за тем, чтобы следы прижигания наблюдались по всему лимбу склеры. После этой процедуры могут применяться различные методы, такие как функциональная биохимическая и иммуногистохимическая оценка структур глаза и другие методы, которые могут быть признаны физиопатологией глаукомы.