Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении белковых взаимодействий с иммобилизованными молекулами-приманками. Это достигается путем предварительного получения и иммобилизации приманки. На втором этапе библиотека фагов, подлежащая скринингу, вводится к приманке в условиях, способствующих связыванию.

Затем несвязавшиеся фаги удаляют путем тщательной промывки. Связавшиеся фаги используют для инфицирования бактерий с последующим выделением. Заключительным этапом является амплификация связанных фагов для следующей итерации аффинного отбора.

В конечном итоге, когда титр фагов выходит на плато, отдельные бляшки отбирают и секвенируют, чтобы определить, какие белки обладают наибольшим сродством к иммобилизованной мишени в данных условиях связывания. Этот процесс позволяет ответить на ключевые вопросы о белок-белковых взаимодействиях. Данная процедура начинается с нанесения очищенного рекомбинантного белка на дно микротитрационных планшетов, как описано в текстовом протоколе.

Следующий этап заключается в инокуляции 50 мл среды Luria burani с добавлением 100 мкг/мл ампициллина в конической колбе Эрленмейера объемом 250 мл одной колонией, предварительно выращенной согласно текстовому протоколу. Инкубируйте при 37 °C и 200 об/мин на горизонтальном шейкере, контролируя плотность клеток с помощью спектрофотометра до достижения оптической плотности при 600 нм в диапазоне 0,5–0,6. Затем перелейте клетки в пробирку Falcon объемом 50 мл или аналогичную емкость и храните при 4 °C до использования; обычно клетки остаются жизнеспособными примерно одну неделю. В первый день подготовьтесь к аффинной селекции, как описано в текстовом протоколе, утром второго дня.

Поместите девять стерилизованных в автоклаве пустых колб Эрленмейера объемом 250 milliliter в зажимы инкубационного шейкера. Инокулируйте 500 milliliters lal burani, добавив 500 microliters из одной из ночных культур клеток BLT 5 4 0 3, зараженных фагом, которые были подготовлены накануне вечером. После помещения колбы в инкубатор включите спектрофотометр и установите его на измерение оптической плотности при 600 nanometers. Тем временем извлеките микротитрационный планшет из холодильника с температурой 4 degrees Celsius и снимите пластиковую пленку. Удалите из планшета весь несвязавшийся белок, промыв лунки 10 раз по 200 microliters на лунку 1X трис-солевым буфером (TBS) pH 7.5, при этом между промывками осторожно постукивая перевернутым планшетом по бумажному полотенцу.

Проведите блокировку, добавив по 200 µL 5% блокирующего реагента в TBS в каждую лунку на один час. Обернув планшет пищевой пленкой, промойте его от блокирующего раствора 10 раз, используя по 200 µL 1X TBST, осторожно прижимая перевернутый планшет к четырем слоям бумажных полотенец между промывками.

С этого момента используйте наконечники с фильтром, чтобы избежать перекрестного загрязнения фагами. Добавьте пипеткой 100 µL библиотеки фагов к белкам. Снова загерметизируйте планшет пищевой пленкой и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа.

По истечении одного часа снимите пищевую пленку с планшета и немедленно промойте его, слив фаги в контейнер для биоопасных отходов. Затем с помощью многоканального дозатора быстро добавьте по 200 µL 1X-T-B-S-T в каждую лунку. Установите таймер на одну минуту.

Через одну минуту слейте буфер в контейнер для биоопасных отходов, встряхните планшет, перевернув его на бумажное полотенце, и верните его на стол. Повторите этапы промывки 10 раз. После 10-й промывки возьмите 200 µL клеток BLT 5 4 0 3 из 50 мл фальконовской пробирки при 4 °C и перенесите их на дно каждой из девяти лунок, из которых была удалена последняя промывочная жидкость.

Оберните чашки пищевой пленкой и выдержите их при 37 °C в течение 20 минут, чтобы фаги, все еще прикрепленные к приманке, успели инфицировать бактерии по истечении 20 минут. Снимите пленку с чашек. Затем отберите 10 µL бактерий из лунки «репликация 1» в BSA при 25 °C и перенесите их в 990 µL среды в пробирке под номером один.

Повторите этот процесс еще дважды для данной лунки, чтобы в итоге получить три трипликата разведения от 1 до 100 фага из этой лунки; это будет первая реплика BSA, отобранная трижды. Эти разведения будут использованы для оценки среднего титра плюс или минус стандартная ошибка среднего для этой реплики BSA. Повторите те же действия для второй и третьей реплик BSA, а также для трех реплицированных лунок отравленного белка-приманки и для белка-приманки; отставьте эти 27 пробирок EOR в сторону. Если оптическая плотность бактерий в колбе составляет от 0.6 до 1.0, перелейте по 50 мл клеток из колбы Ферна в каждую из 9 колб Эрленмейера объемом 250 мл.

Возьмите оставшиеся 170 µL бактерий BLT 5 4 0 3, инфицированных фагом, из лунки BSA replication one и добавьте их к 50 mL клеток с маркировкой BSA rep.One. Повторите это для всех девяти лунок перед тем, как поместить колбы на шейкер в инкубатор при 37 °C. Тем временем выполните серию разведений на основе исходных 27 разведений, взяв 100 µL среды LB с бактериями из пробирки Einor tube one и добавив их к 900 µL среды LB в пробирке einor tube.

Для разведения 10⁻³ замените наконечник с фильтром на новый, затем возьмите 100 µL среды LB с бактериями из пробирки четыре и добавьте их к 900 µL среды LB в пробирке семь. Для разведения 10⁻⁴ продолжите процедуру разведения для всех трех повторов всех репликаций всех белков и вариантов обработки. После лизиса клеток всего должно получиться 135 пробирок.

Доведите концентрацию хлорида натрия в культуре до 0,5 М, добавив 5 мл 5 М стокового раствора хлорида натрия; перенесите образец в маркированный центрифужный флакон и центрифугируйте при 8 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Затем декантируйте супернатант, содержащий вирус, в чистую стерильную пробирку Falcon объемом 50 мл. Добавьте несколько капель хлороформа в декантированный супернатант в пробирке Falcon.

Супернатант можно хранить при температуре four degrees Celsius до следующего раунда аффинного отбора; на третий день перенесите пипеткой 250 microliters клеток VLT 5 4 0 3 из четырех градусов Цельсия в каждую из предварительно подготовленных пронумерованных боросиликатных пробирок. Затем перенесите пипеткой 100 microliters из разведения в пробирке один в 250 microliters клеток в боросиликатной пробирке номер один. Кратковременно прогрейте первые пять дюймов пипетки над пламенем и погрузите ее в расплавленный top aros.

Наберите три миллилитра и быстро внесите в пробирку поверх клеток и фага. Перемешайте, слегка постукивая по пробирке пальцем, удерживая ее другой рукой, затем вылейте содержимое на чашку. Наклоните чашку и с помощью пробирки разгладьте пузырьки воздуха и сухие участки до тех пор, пока вся поверхность чашки не будет покрыта верхним слоем агарозы.

Оставьте пробирку в вертикальном положении на лабораторном столе для охлаждения. Утилизируйте боросиликатную трубку. Извлеките наконечник с фильтром, замените его новым и повторяйте процедуру до тех пор, пока не будут высеяны все разведения.

Доставайте подготовленные чашки из инкубатора по мере необходимости, но не более шести за один раз, иначе они остынут и верхний слой агарозы затвердеет слишком быстро; осмотрите образовавшиеся на чашках бляшки и утилизируйте те, на которых наблюдается слитный лизис. Определите, в каких из оставшихся серийных разведений образовалось достаточно мало бляшек для точного подсчета. Запишите количество бляшек на этих чашках и рассчитайте титр в соответствии с текстовым протоколом в конце раздела по аффинной селекции. На четвертом этапе выберите 18 отдельных, четко выраженных колоний бляшек, используя стерильный желтый наконечник дозатора.

Смочите внутреннюю поверхность наконечника раствором трис-гидрохлорида (pH 8.5) в пробирке Einor. Затем вырежьте керн из бляшек на чашках для титрования, проталкивая наконечник сквозь хорошо изолированную бляшку непосредственно в пластиковую чашку Петри снизу и аспирируя керн; перед перемешиванием на вортексе вытолкните керн в 100 µL трис-гидрохлорида (pH 8.5) в соответствующую пробирку. Кратковременно нагрейте 20 µL из этого объема при 65 °C в течение 10 минут, затем проведите ПЦР и секвенирование, как описано в текстовом протоколе. Здесь представлены типичные результаты титрования; при многократном отборе проб окончательные расчетные значения менее подвержены ошибкам пипетирования, что позволяет получить более точную оценку фактического титра и вариации вокруг него.

Поквартальные оценки показывают преимущественное увеличение титра фагов в лунках с неотравленной приманкой по мере увеличения количества раундов аффинного отбора. Это также подтверждает эффективность применяемого метода. Рост процентного содержания фагов со вставкой в лунках с неотравленной приманкой по мере увеличения числа селекций является благоприятным признаком после проведения продвинутых раундов аффинного отбора.

Увеличение количества независимо выделенных фагов, содержащих вставку по сравнению с первым раундом, а также сосредоточение этих ампликонов в нескольких полосах одинакового размера являются хорошим признаком того, что в процессе данного аффинного селективного отбора отбираются конкретные клоны. Для подтверждения взаимодействий, обнаруженных методом фагового дисплея, могут быть применены другие методы, такие как дрожжевая двугибридная система.