Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Общая цель этой процедуры — обнаружить взаимодействие белков с иммобилизованными молекулами приманки. Это достигается путем предварительного приобретения и обездвиживания приманки. Второй шаг заключается во введении в приманку экранируемой библиотеки фагов в условиях, способствующих связыванию.

Далее несвязанные фаги удаляются путем строгого промывания. В то время как связанные фаги используются для заражения бактерий перед их выздоровлением. Последним шагом является амплификация связанного фага для следующей итерации аффинного отбора.

В конечном счете, когда титр фагов достигает плато, отдельные бляшки отбираются и секвенируются, чтобы показать, какие белки имеют наибольшее сродство к иммобилизованному отставанию в условиях экспериментального связывания. Этот процесс может помочь ответить на ключевые вопросы о взаимодействии белковых белков. Эта процедура начинается с того, что очищенный рекомбинантный белок помещается в нижнюю часть микротитровальных планшетов, как описано в текстовом протоколе.

Следующим шагом является инокуляция 50 миллилитров среды Luria burani со 100 микрограммами на миллилитр ампициллина в колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров с одной колонией, которая была предварительно выращена, как описано в текстовом протоколе, инкубация при 37 градусах Цельсия, 200 оборотов в минуту в горизонтальном вибростенде и использование спектрофотометра для контроля плотности клеток до тех пор, пока не будет получена оптическая плотность на 600 нанометрах от 0,5 до 0,6. Затем налейте клетки в 50-миллилитровую пробирку Falcon или аналогичную и держите при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока используемые клетки обычно не останутся жизнеспособными примерно в течение одной недели в первый день. Подготовьтесь к выбору сродства, как описано в текстовом протоколе, утром второго дня.

Поместите девять автоклавов пустых, 250 миллилитровых колб Эрленмейера в зажимы инкубационного шейкера, закиньте 500 миллилитров лал бурани с 500 микролитрами из одной из ночных культур фагов зараженных BLT 5 4 0 3 клеток, запущенных накануне вечером после помещения колбы в инкубатор, включите спектрофотометр и установите его на считывание поглощения на уровне 600 нанометров. Тем временем снимите микротитровую пластину с четырех градусов Цельсия и снимите полиэтиленовую пленку. Удалите любой несвязанный белок с тарелки, промыв 10 раз 200 микролитров на лунку одним X трис буферизованным физиологическим раствором или TBS pH 7,5 и ударив тарелку вверх дном по бумажному полотенцу между стирками.

Заблокируйте 200 микролитрами на лунку 5%-ного блокирующего реагента в TBS на один час. Завернув тарелку в полиэтиленовую пленку, смойте блокирующий раствор 10 раз 200 микролитрами одного X-T-B-S-T, взмахнув тарелку вверх дном по четырем слоям бумаги. Полотенце между стирками.

Отсюда используйте фильтрующие барьерные наконечники, чтобы избежать перекрестного загрязнения фагов. Пипеткой введите 100 микролитров фаговой библиотеки вместе с белками. Снова запечатайте тарелку полиэтиленовой пленкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение часа.

По истечении одного часа снимите полиэтиленовую пленку с тарелки и немедленно промойте, вытряхнув фаг в биологически опасные отходы. Затем с помощью нескольких дозаторов быстро добавьте 200 микролитров одного X-T-B-S-T в каждую. Ну и установите таймер на одну минуту.

Через минуту вытряхните буфер в биологически опасные отходы, ударьте тарелку вверх дном по бумажному полотенцу и поставьте ее обратно на скамейку. Повторите шаги стирки 10 раз после 10-й стирки. Возьмите по 200 микролитров BLT 5, 4, 0, 3 ячейки из 50-миллилитровой соколиной пробирки при четырех градусах Цельсия и переложите на дно каждую из девяти лунок, из которых была удалена последняя промывка.

Заверните пластины в пищевую пленку и поставьте ее при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут, чтобы любой фаг все еще прилип к приманке и заразил бактерии по истечении 20 минут. Разверните тарелки. Далее удалите 10 микролитров бактерий из БСА при 25 градусах Цельсия репликацией в одну лунку и переведите в 990 микролитров средней маркировки.

Повторите этот процесс еще дважды для этой лунки, в результате чего получите три тройки от одного до 100 дилу фага из этой лунки, это репликация BSA, одна выборка взята три раза. Эти разведения будут использоваться для оценки среднего титра плюс-минус стандартная ошибка среднего значения для репликации БСА, сделайте то же самое для репликации двух и трех БСА для трех реплицированных лунок отравленного белка приманки, а для белка приманки отложите эти 27 трубок с МУН. Если бактерии в колбе имеют оптическую плотность от 0,6 до 1,0, сцедите 50 миллилитров клеток из колбы папоротника в каждую из 9 250 миллилитровых колб Эрленмейера.

Возьмите оставшиеся 170 микролитров инфицированных фагами бактерий BLT 5 4 0 3 в репликации BSA одну лунку и добавьте их к 50 миллилитрам клеток, помеченных как BSA rep. Один. Проделайте это для всех девяти лунок перед встряхиванием колб в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Тем временем выполните разведение из первоначальных 27 разведений, взяв 100 микролитров LB с бактериями из пробирки Эйнора и добавив их к 900 микролитрам LB в пробирке Эйнора.

Четыре для 10 до минус третьего разбавления, выбросьте барьерный наконечник фильтра в пользу нового, прежде чем получить 100 микролитров LB с бактериями из четвертой трубки эйнора и добавить его к 900 микролитрам LB в eph пробирке. Семь для 10 до минус четвертого разведения, продолжайте разведение для всех трипликаторов всех репликаций всех белков и обработок. Всего должно быть 135 трубок после того, как клетки будут лежать.

Доведите культуру до 0,5 молярного хлорида натрия, добавив пять миллилитров из пяти моляров хлорида натрия и перенеся образец в центрифугу с маркировкой в центрифуге при 8 000 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем сцедите надосадочную жидкость, содержащую вирус, в чистую, стерильную 50-миллилитровую соколиную пробирку. Добавьте несколько капель хлороформа в сцеженную надосадочную жидкость в пробирке Falcon.

Надосадочная жидкость может быть сохранена при температуре четыре градуса Цельсия для следующего раунда отбора аффинности на третий день, пипетка 250 микролитров VLT 5 4 0 3 клеток с четырех градусов Цельсия в каждую из заранее подготовленных пробирок с босиликатными пробирками. Затем пипетку 100 микролитров из разведения в пробирке Эйнора один на 250 микролитров клеток в бурсиликатной пробирке. Один. Кратковременно нагрейте первые пять дюймов пипетки над пламенем и погрузите ее в расплавленную верхнюю часть арос.

Наберите вверх три миллилитра и быстро введите в пробирку сверху клетки и фаг. Перемешайте, щелкая пальцем, держа трубку другой рукой, а затем вылейте содержимое на тарелку. Наклоните пластину и используйте пробирку для борьбы с пузырьками и сухими пятнами, пока вся пластина не будет покрыта верхним агросом.

Отложите его вертикально на скамейку, чтобы он остыл. Выбросьте силикатную трубку бороса. Извлеките барьерный наконечник фильтра и возьмите новый, продолжайте до тех пор, пока все разбавления не будут покрыты.

Доставайте подготовленные пластины из инкубатора по мере их истощения, но не более шести за раз, иначе они остынут, и верхушка агроса затвердеет слишком быстро, осмотрите образовавшийся на пластинах налет и выбросьте те, которые имеют сливающийся лизис. Определите, какие из оставшихся серийных разведений дали достаточно мало бляшек, чтобы можно было точно записать количество бляшек с этих пластин, и приступайте к расчету титра, как описано в текстовом протоколе в конце выбора аффинности. В четвертом раунде выберите 18 отдельных четко определенных колоний бляшек с помощью стерильного желтого наконечника для пипетки.

Смочите внутреннюю часть наконечника трис гидрохлоридом pH 8,5 в пробирке эйнора. Затем удалите эти бляшки из тидерующихся пластин, протолкнув наконечник через хорошо изолированную пластину непосредственно в пластиковую чашку Петри внизу и, аспирируя ядро, вытолкните ядро в 100 микролитров трис гидрохлорида pH 8,5 в соответствующей пробирке перед вортексом. Вкратце, нагрейте 20 микролитров от этого объема при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут и продолжайте ПЦР и секвенирование, как описано в текстовом протоколе, показанном здесь, являются типичными результатами титра путем многократной выборки окончательных расчетных показателей, не так восприимчивы к ошибкам пипетирования и более точной оценке фактического титра и вариаций вокруг него.

Оценка от скважины к хорошо получаются, увеличивая титр фагов преимущественно для неотравленной приманки по мере увеличения числа раундов отбора аффинности. Также обеспечивает уверенность в том, что техника работает. Удержание возрастающего процента фагового вкладыша в неотравленных приманочных колодцах по мере увеличения числа аффинных отборов также является благоприятным после продвинутых раундов аффинного отбора.

Увеличение числа независимо восстановленных фагов, которые имеют вставку относительно первого раунда, и размещение этих ампликонов на нескольких полосах одинакового размера является хорошим признаком того, что определенные клоны отбираются при аффинном отборе после этой процедуры. Другие методы, такие как гибридная легкость два, могут быть выполнены для проверки взаимодействий, обнаруженных фаговым дисплеем.