Стратегия биосенсорного анализа высокой пропускной способности и биоинформатики для глобальной проверки взаимодействий между наркотиками и белком
1 декабря 2020 г.
Это исследование было направлено на представление стратегии для выявления лекарственно-пептидных взаимодействий. Стратегия включает в себя биопанирование лекарственных признанных коротких пептидов на основе кварцево-кристаллического микробаланса (ККМ) биосенсора, а затем биоинформатический анализ для количественной оценки информации, полученной для распознавания наркотиков и аннотации лекарственных обязательных участков на белках.
Идентификация низкомолекулярных белковых взаимодействий имеет важное значение для исследований и разработки лекарств, а также для углубления понимания патологических механизмов, лежащих в основе DTC вируса. Этот метод способствует высокопроизводительной биопанорамной обработке пептидов, распознающих лекарственные средства, и глобальной валидации сайтов связывания лекарственных средств на белках для низкомолекулярных лекарственных средств, представляющих интерес. Чтобы получить чип датчика ККМ, прикрепите керамический чип датчика к генератору аппарата СМК с частотой 27 МГц и зарегистрируйте собственную частоту в воздушной фазе перед иммобилизацией малых молекул.
После записи отсоедините микросхему и осторожно добавьте 20 микролитров капли одномиллимолярного мелкомолекулярного производного в 70% этанола для создания самоорганизующегося монослоя на золотом электроде сенсорной микросхемы. Поместите чип в чашку Петри, выстланную влажной тканью, защитите ее от света в течение одного часа при комнатной температуре, а затем аккуратно промойте поверхность электрода ультрачистой водой. Высушите чип под легким воздействием воздуха и загрузите чип на аппарат QCM.
Через час запишите уменьшение частоты в воздушной фазе, чтобы измерить количество малой молекулы, которая была иммобилизована. Для биопанорамирования T7 Phage Library поместите кювету со специальной магнитной мешалкой на биосенсор QCM, настроенный на 1000 оборотов в минуту, и добавьте восемь миллилитров реакционного буфера в кювету Во время перемешивания буфера присоедините чип датчика QCM к генератору Удерживайте рычаг генератора, чтобы погрузить чип в буфер и начать мониторинг частоты QCM. Когда грамм сенсора уравновешивается с частотным дрейфом примерно в три Гц в минуту, введите восемь микролитров библиотеки фагов Т7 в кювету и отметьте точку инжекции на датчике.
Отслеживайте снижение частоты, вызванное связыванием фагов Т7 с небольшой молекулой, иммобилизованной на поверхности золотого электрода. Через 10 минут остановите частотный монитор QCM и быстро поднимите генератор, чтобы извлечь микросхему датчика из пакета, отсоедините микросхему датчика от генератора и снимите буфер с микросхемы. Поместите высушенный сенсорный чип во влажную чашку Петри и добавьте 20 микролитров капли логарифмической фазы E-coli на золотой электрод.
Инкубируйте чашку на 96-луночном микропланшетном миксере при температуре 37 градусов Цельсия и частоте от 1000 до 1500 оборотов в минуту в течение 30 минут, защищенной от света, чтобы усилить восстановление связанных семи фагов Т7. В конце инкубации переложите 20 микролитров суспензии кишечной палочки в 200 микролитров ЛБ среды. В соответствии с общей методикой проводят выделение фаговой бляшки в среде и секвенирование ДНК, кодирующей распознавание пептидных последовательностей препарата, отображаемых на каждом фаговом капсиде.
В качестве послеоперационного обслуживания чипа датчика используйте 1% раствор додецилсульфата натрия, смоченный ватным тампоном, для очистки поверхности электрода промойте золотую поверхность ультрачистой водой и высушите электрод воздухом. Затем обработайте поверхность электрода пятью микролитрами свежеприготовленного раствора Параны в течение пяти минут, после чего следует промывка ультрачистой водой и сушка на воздухе два раза. Для проведения биоинформатического анализа с помощью RELIC распакуйте автономную программу RELIC на ПК с операционной системой Windows и используйте аминокислотные последовательности выбранных лекарств 15 мер-пептидов или одного или нескольких белков в каждом текстовом файле с быстрым форматом A.
Поместите необходимые текстовые файлы в папку AA-div, info, motif, match, hetero align, fast A con или fast A scan. Щелкните каждый исполняемый файл в независимой папке, чтобы открыть персональную версию FTN 95, и введите соответствующее имя файла и расширение в командной строке, чтобы выполнить каждую программу и получить полученный файл в текстовом формате. Полученные файлы в текстовом формате показаны здесь.
Затем экспортируйте полученный текстовый файл в электронную таблицу для создания графика информационного наполнения или кумулятивных оценок сходства, рассчитанных с помощью удара около 62. Используя эту стратегию, были успешно идентифицированы одиночные и множественные сайты связывания малых молекул на белках-мишенях для шести низкомолекулярных препаратов. Например, 29 пептидов, которые распознают клинически одобренный препарат иринотекан, иммобилизованный как самоорганизующийся монослой, были идентифицированы с помощью биосенсора QCM на основе биопанорамирования за один цикл. Последующее попарное выравнивание 29 пептидов и ацетилхолинэстеразы дало максимальные баллы для специфических аминокислотных остатков, которые соответствовали тем, которые составляют сайт связывания иринотекана.
Это же подмножество пептидов было успешно идентифицировано в непосредственной близости от каталитической триады в карбоксилэстеразе, что указывает на то, что эти аминокислоты образуют каркас для распознавания иринотекана во время деэтерификации. 27 пептидов, которые распознают противогриппозный препарат осельтамивир, покрывая поверхность золотого электрода чипа датчика QCM, успешно обнаружили сайт связывания осельтамивира в нейраминидазе. Этот сайт связывания состоит из неструктурированных пептидных пептидных петель, которые потенциально подвергаются динамическому движению при стыковке с осельтамивиром.
Лекарственные препараты, регионы, химические вещества, рекомбинантные бактериофаги и бактерии являются биологическими катафалками и должны обрабатываться в соответствии с протоколом получения культуры. Не забывайте всегда надевать перчатки, очки и лабораторный халат для безопасности. После этой процедуры белки-мишени для различных лекарств могут быть глобально валидированы на людях, патологических вирусах и даже растениях, чтобы понять молекулярные механизмы и потенциальную терапевтическую эффективность интересующих лекарств.
Обзор
Это исследование представляет стратегию для выявления взаимодействий лекарственных средств с пептидами с использованием биосенсора на основе микробаланса из кварцевого кристалла (QCM). Метод включает биопанинг пептидов, распознающих лекарства, и биоинформатический анализ для оценки распознавания и связывания лекарств на белках.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Разработка лекарств
- Биотехнологии
Предыстория
- Понимание взаимодействий между малыми молекулами и белками важно для исследований лекарств.
- Необходимы методы с высокой пропускной способностью для биопанинга пептидов.
- Биосенсоры QCM предоставляют платформу для изучения связывания лекарств.
- Определение мест связывания помогает в разработке терапевтических средств.
Цель исследования
- Разработать метод для выявления пептидов, связывающихся с лекарствами.
- Подтвердить места связывания лекарств на целевых белках.
- Улучшить понимание взаимодействий лекарств на молекулярном уровне.
Используемые методы
- Подготовка чип-сенсоров QCM для иммобилизации малых молекул.
- Биопанинг с использованием библиотек фагов T7 для выявления связывающихся пептидов.
- Мониторинг изменений частоты в QCM для оценки связывающихся взаимодействий.
- Биоинформатический анализ для оценки последовательностей пептидов.
Основные результаты
- Успешное выявление пептидов, распознающих лекарства, такие как Иринотекан и Осельтамивир.
- Характеристика мест связывания на белках, таких как ацетилхолинэстераза и нейраминидаза.
- Демонстрация эффективности метода в подтверждении взаимодействий лекарств.
Выводы
- Стратегия эффективно выявляет места связывания лекарств на белках.
- Метод может быть применен к различным лекарствам для получения терапевтических знаний.
- Улучшает понимание молекулярных механизмов действия лекарств.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This biosensor-based high throughput strategy enables rapid global validation of drug-protein interactions, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying drug-recognizing peptides and mapping binding sites on target proteins, the method enhances predictive confidence in lead selection and reduces biological uncertainty in preclinical development. The approach applies to diverse small molecules, offering a reusable capability for assessing ADMET-relevant interactions across therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying peptide sequences that recognize drug-binding sites on proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through high throughput biopanning of T7 phage-displayed peptides immobilized on QCM biosensors.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by highlighting amino acid residues consistent with known drug-binding sites, such as the catalytic triad in carboxylesterase for irinotecan recognition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative frequency shift data from QCM biosensor to measure small molecule immobilization and phage binding kinetics.
- Operational Value: Establishes a reproducible, label-free assay format for monitoring biomolecular interactions in real time with minimal sample consumption.
- Scalability: Enables parallel processing of phage libraries and bioinformatics analysis via RELIC suite for high throughput peptide screening and motif identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro binding data to biological relevance by validating drug recognition in pathogenic contexts, such as neuraminidase for oseltamivir.
- Disease-Relevant System: Applies to target proteins in humans, viruses, and plants, supporting cross-species validation of drug mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement and binding site fidelity before investing in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing orthogonal confirmation of drug-target interactions that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating drug-recognizing peptides and clarifying binding site topology on target proteins.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized peptide outputs suitable for downstream epitope mapping and antibody development.
- Analytics: Yields quantifiable binding metrics (frequency shifts) and bioinformatics-derived similarity scores to rank peptide candidates and validate binding specificity.
- Translational Research: Connects molecular binding data to functional outcomes by linking peptide sequences to enzyme inhibition or viral replication assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for repeated application across drug classes, targets, and model systems without reformatting core workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct evidence of drug-peptide interaction and binding site mapping.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized QCM sensor preparation and phage recovery protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failed targets through early mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of drug candidates based on validated target engagement and interaction topology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in QCM biosensor operation, phage display techniques, and bioinformatics analysis using RELIC suite.
- Depends on access to 27 MHz QCM apparatus, magnetic stirrer cuvettes, and compatible sensor chips for small molecule immobilization.
- Necessitates standardized buffer conditions and incubation parameters to ensure consistent phage binding and recovery across runs.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different protein targets or small molecule chemistries beyond the demonstrated irinotecan and oseltamivir models.
- Includes practical limitations such as the need for careful surface regeneration between cycles to maintain sensor sensitivity and avoid cross-contamination.
