Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Этот эксперимент с флуоресцентной микроскопией оценивает жизнеспособность отдельных бактерий, связанных с клетками-хозяевами, и определяет жизнеспособность бактерий в различных субклеточных местах. Во-первых, чтобы идентифицировать внешние бактерии, подвергните инфицированные клетки воздействию флуоресцентного реагента, специфичного для пермеазы бактерий, инфицированного хозяина в присутствии флуоресцентных красителей, которые отличают жизнеспособные бактерии от нежизнеспособных на основе целостности бактериальной мембраны. Затем, чтобы указать, где бактерии находятся внутри клеток хозяина, инкубируйте инфицированные клетки с флуоресцентно связанным антителом до маркера, представляющего интерес.

Полученные иммунофлуоресцентные изображения могут определить процент жизнеспособных бактерий внутри и снаружи клеток-хозяев, а также субклеточную локализацию жизнеспособных и нежизнеспособных внутриклеточных бактерий. В отличие от анализа количества колоний, анализа гентамициновой защиты и электронной микроскопии, этот метод позволяет напрямую оценить жизнеспособность отдельных бактерий. Он также может выявить, имеют ли бактерии в разных субклеточных компартментах различия в своей жизнеспособности.

Демонстрировать эту процедуру будет Бриттани Джонсон, аспирант из моей лаборатории, Атори, чтобы клетки культивировались на круглом стекле на 24 стекла, хорошо планшеты добавляют интересующие бактерии и инкубируют в течение нужного времени. Один раз аккуратно промойте инфицированные клетки. Затем добавьте сопряженное антитело Alexa Fluor 6 4 7 или бактериальный специфический лектин для обнаружения внешних бактерий и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.

После двух полосканий отсадить среду и добавить 0,5 миллилитра окрашивающего раствора живых умерших, содержащего цитон девять и йод пропидия. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте, затем дважды промойте в швабрах хлорид магния. Переверните крышки лицевой стороной вниз на стеклянные предметные стекла.

Запечатайте прозрачным лаком для ногтей. Получите изображения в течение 30 минут с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами фильтров, подробно описанными в текстовом протоколе для маркировки бактерий. Добавьте 10 мкг на миллилитр DPI в определенную среду и выдерживайте в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.

Теперь заразите адгезивные клетки бактериями, меченными DPI. Не фиксируйте клетки альдегидами или органическими растворителями. Промойте клетки один раз.

Затем добавьте Alexa Fluor 6, 4, 7 сопряженное антитело или лектин и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. После двух полосканий буфером для швабры добавьте сопряженное антитело Alexa Fluor 5 5, 5 против интересующего субклеточного маркера и инкубируйте в течение 20 минут. Затем аспирируйте среду и добавьте 0,4 микромоляра зеленого цвета, инкубируйте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте, дважды обрежьте клетки в швабрах, хлорид магния.

Затем промойте клетки. Еще раз в швабру хлористый магний в течение пяти минут. Переверните крышку стекол лицевой стороной вниз на стеклянные предметные стекла, запечатайте прозрачным лаком для ногтей, получите снимки предметных стекол в течение 30 минут на флуоресцентном микроскопе.

В этом эксперименте нейтрофилы человека были заражены гонореей. Соевый лектин Alexa Fluor 6 4 7 обнаруживает внеклеточную гонорею. Затем зеленая флуоресцентная жизнеспособность погибает, и красный флуоресцентный йодид пропидиума был добавлен в присутствии сапонина, который изолирует холестерин для преимущественного проникновения через плазматические мембраны клетки-хозяина, но не проникает через мембрану гонореи в инфицированных клетках, ядро эукариотической клетки окрашивается как цито-девятью, так и йодидом пропидия.

Эти изображения нейтрофилов, инфицированных гонореей, были получены с использованием красителей жизнеспособности, cyt, talk screen и dpi. Краситель йодида пропидия не использовался, так как он флуоресцирует как в красных, так и в ультрафиолетовых каналах флуоресцентного микроскопа. Все гонореи окрашивают с помощью dpi, но только бактерии с поврежденными мембранами окрашивают воловьей зеленью.

Нежизнеспособные внутриклеточные бактерии имеют кольцо окрашивания для CD 63, окружающее бактерии. Это кольцо указывает на то, что первичные гранулы обогащены этой фагосомой. Жизнеспособная внутриклеточная бактерия не обладает окрашиванием для CD 63, что указывает на то, что первичные гранулы не обогащены в ее фагосоме. Взятый.

В совокупности данные показывают корреляцию между жизнеспособностью гонореи и резидентами в первичной гранулярно-отрицательной фагосоме. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить жизнеспособность бактерий в клетках хозяина. Кроме того, вы сможете определить жизнеспособность бактерий, локализованных в различных компартментах в клетках-хозяевах, используя антитела, направленные против этих субклеточных компартментов.