Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

В данном эксперименте с использованием флуоресцентной микроскопии оценивается жизнеспособность отдельных бактерий, связанных с клетками хозяина, и определяется жизнеспособность бактерий в различных субклеточных локализациях. Сначала, для идентификации внешних бактерий, инфицированные клетки подвергают воздействию флуоресцентного реагента, специфичного к бактериальной пермеазе, а затем — воздействию флуоресцентных красителей, которые позволяют отличить жизнеспособные бактерии от нежизнеспособных на основе целостности бактериальной мембраны. Затем, для определения локализации бактерий внутри клеток хозяина, инфицированные клетки инкубируют с антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой к интересующему маркеру.

Полученные иммунофлуоресцентные изображения позволяют определить процент жизнеспособных бактерий внутри и вне клеток-хозяев, а также субклеточную локализацию жизнеспособных и нежизнеспособных внутриклеточных бактерий. В отличие от методов подсчета колоний, тестов на защиту гентамицином и электронной микроскопии, данный метод позволяет напрямую оценить жизнеспособность отдельных бактерий. Он также может выявить различия в жизнеспособности бактерий, находящихся в разных субклеточных компартментах.

Эту процедуру продемонстрирует Бриттани Джонсон, аспирантка моей лаборатории. К клеткам, культивируемым на круглых стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах, добавьте интересующие бактерии и инкубируйте в течение необходимого времени. Осторожно промойте инфицированные клетки один раз. Затем добавьте антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 647, или бактериально-специфичный лектин для обнаружения внешних бактерий и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.

После двух промывок аспирируйте среду и добавьте 0,5 миллилитра раствора для окрашивания живых и мертвых клеток, содержащего cyto nine и пропидия йодид. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темном месте, затем дважды промойте в растворе mops magnesium chloride. Переверните покровные стекла лицевой стороной вниз на предметные стекла.

Закрепите прозрачным лаком для ногтей. Снимите изображения в течение 30 минут с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами фильтров, подробно описанными в текстовом протоколе, для маркировки бактерий. Добавьте 10 µg/mL DPI в среду mors и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.

Теперь инфицируйте адгезивные клетки бактериями, меченными DPI. Не фиксируйте клетки альдегидами или органическими растворителями. Промойте клетки один раз.

Затем добавьте антитело или лектин, конъюгированный с Alexa Fluor 647, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. После двух промывок буфером MOPS добавьте антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 555, против интересующего субклеточного маркера, и инкубируйте в течение 20 минут. После двух промывок буфером MOPS один раз промойте клетки буфером MOPS с хлоридом магния. Затем аспирируйте среду и добавьте 0,4 µM Cy3 green; инкубируйте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте, затем дважды промойте клетки буфером MOPS с хлоридом магния.

Затем промойте клетки. Еще один раз в MOPS с хлоридом магния в течение пяти минут. Переверните покровные стекла лицевой стороной вниз на предметные стекла, загерметизируйте бесцветным лаком для ногтей и получите изображения предметных стекол с помощью флуоресцентного микроскопа в течение 30 минут.

В данном эксперименте нейтрофилы человека были инфицированы гонококками. Соевый лектин, конъюгированный с Alexa Fluor 647, выявляет внеклеточные гонококки. Затем в присутствии сапонина были добавлены зеленый флуоресцентный краситель для определения жизнеспособности и красный флуоресцентный пропидий иодид; сапонин связывает холестерин, что позволяет преимущественно пермеабилизировать плазматические мембраны клеток-хозяев, но не проникает через мембраны гонококков в инфицированных клетках. Ядро эукариотической клетки окрашивается как Cyto 9, так и пропидий иодидом.

Эти изображения нейтрофилов, инфицированных гонореей, были получены с использованием красителей жизнеспособности cyt talk screen и dpi. Краситель проидиум иодид не использовался, так как он флуоресцирует как в красном, так и в ультрафиолетовом каналах флуоресцентного микроскопа. Все бактерии гонореи окрашиваются dpi, но только бактерии с поврежденными мембранами окрашиваются ox green.

Нежизнеспособная внутриклеточная бактерия окружена кольцом окрашивания на CD 63. Это кольцо указывает на обогащение данной фагосомы первичными гранулами. Жизнеспособная внутриклеточная бактерия не имеет окрашивания на CD 63, что свидетельствует об отсутствии обогащения ее фагосомы первичными гранулами.

В совокупности эти данные демонстрируют корреляцию между жизнеспособностью гонококков и их пребыванием в первичных гранулах отрицательных фагосомах. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как оценивать жизнеспособность бактерий в клетках хозяина. Кроме того, вы сможете определять жизнеспособность бактерий, локализованных в различных компартментах клеток хозяина, используя антитела к этим субклеточным компартментам.