Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной Хламидиоз Вакуоли Динамика роста в живых клетках

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке динамики роста хламидийных включений в живых клетках. Это достигается путем создания сначала флуоресцентных клеток-хозяев, которые стабильно экспрессируют флуоресцентный белок, такой как GFP, в своей цитоплазме. Затем клетки-хозяева заражаются хламидиозом и получают возможность инкубации.

Затем инфицированные клетки визуализируются с помощью живой флуоресцентной микроскопии. Наконец, характеристики включения хламидий количественно оцениваются с помощью программного обеспечения для анализа под микроскопом, в конечном итоге используется живая флуоресцентная микроскопия для визуализации хламидийных включений в клетке-хозяине и измерения биологических параметров включений для получения количественных результатов. Основные преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, такими как перечисление на основе антител, заключаются в том, что эта стратегия обратной визуализации может быть использована на живых клетках, а также в сотрудничестве с другими флуоресцентными метками для количественной оценки динамики включения всех видов хламидий.

Кроме того, в отличие от рутинных методов, которые мечут бактерии в клетках, этот подход освещает мембрану включения в живых клетках и, таким образом, может выявить важные динамические свойства этого компартмента, содержащего патоген. После генерации флуоресцентных клеток Hela, в соответствии с текстовым протоколом, клетки GFP Hela на желаемом культуральном сосуде, таком как стеклянные донные чашки для визуализации высокого разрешения 4 24-луночных планшета для определения IFU и многолуночного скрининга, размораживают замороженную пробирку, содержащую crich cotus, или любой другой желаемый штамм хламидийной кислоты на льду и разбавляют в HBSS до желаемой кратности инфекции. Чтобы провести статическую инфекцию Crich Cotus, LGV zero VL 2 отсасывают среду из лунок и используют HBSS для промывания гела-клеток GFP.

Добавьте в лунки разведенные бактерии и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух часов, отсасывайте клетки и промойте HBSS. Затем, после добавления питательной среды, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом для проведения центрифугирования инфекции crich to serovar D или любым другим хламидийным штаммом. Используйте HBSS для промывания клеток GFP hela и добавления в клетки разбавленных бактерий.

Затем поместите чашку с зараженными клетками в многолуночный держатель вращающегося ротора ведра в настольной центрифуге. Центрифугируйте ячейки при температуре 900 G и 25 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем поместите пробирки для культивирования в инкубатор с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на один час в шкаф биобезопасности, отсасывайте клетки, дважды промойте HBSS и добавьте питательную среду.

Инкубируйте чашку с зараженными клетками при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы визуализировать включения хламидиоза, удалите инфицированные хламидиозом клетки GFP hela из инкубатора углекислого газа и используйте RPMI без фенолового красного и 5% FBS Чтобы заменить среду, поместите чашку или многолуночный планшет на инвертированный флуоресцентный микроскоп с объективом масла 20x или выше. Используя программное обеспечение для визуализации, определите инфицированные хламидиозом клетки GFP, которые выглядят как зеленые клетки, содержащие большие черные дыры.

В диалоговом окне настройки сбора данных настройте программное обеспечение для получения зеленого канала и любого другого канала, добавленного в пример. Используйте кнопку записи с косой чертой, чтобы получить изображение в нужное время. После заражения. Удалите зараженные хламидиозом клетки GFP hela из инкубатора и поместите чашку на инверторный флуоресцентный микроскоп.

Сосредоточьтесь на средних равнинах ячеек, где включения достигают максимального диаметра и урожайности. Четкие края позволяют получать изображения не менее чем в 10 полях на лунку. Скважины обычно представляют собой реплики или экспериментальные переменные.

Чтобы найти ячейки GFP hela на вкладке измерений, используйте команду найти объекты и выберите зеленый канал. Отрегулируйте пороговую интенсивность в зависимости от относительной интенсивности ячеек. Вручную подсчитайте количество включений или черных компартментов и гела-клеток GFP на глаз или используйте программные алгоритмы визуализации для автоматической идентификации и подсчета включений.

Отфильтруйте выбранные объекты, оставив только те объекты, которые больше пяти квадратных микрометров. Назовите это популяцией номер один. Используя эту популяцию, примените команду заполнения отверстий в объектах в качестве входных данных, поскольку на этом шаге создается вторая популяция.

Вычтите популяцию 1 из популяции 2, чтобы получить положительно выраженные включения хламидий, обозначенные как популяция три. Используйте команду filter population, чтобы применить фильтр размера к заполняемости three. Например, при хранении объектов размером более 25 квадратных микрометров для включений в клетках, инфицированных в течение 24 часов или дольше на ранних этапах заражения, установите фильтр по размеру для хранения объектов размером более четырех квадратных микрометров.

Поскольку эти включения намного меньше, фильтр по размеру приводит к получению совокупности объектов, обозначенных как включения. Используйте программное обеспечение для обработки изображений для вычисления количественных данных по изображениям, таких как число включений, включение, размер и включение. Окружность при инфицировании хламидиозом легко видна в виде черных пятен и клеток хозяина или флуоресцентного белка, экспрессирующих хламидии в клетках хозяина, и их четкость может быть использована для автоматической идентификации в многочисленных полях зрения и/или лечения.

Как показано на этом графике, одним из основных применений является определение образующих звеньев включения хламидий в живых инфицированных клетках, что устраняет необходимость в процедурах иммунофлуоресценции, которые являются трудоемкими и дорогостоящими. Еще одной ключевой особенностью этого подхода к визуализации является то, что его можно легко применять к любому виду или штамму хламидий. В этом примере для каждого из этих видов и штаммов был проведен анализ временного хода гела-клеток GFP, инфицированных одним из четырех видов или штаммов хламидийных клеток.

Включения были помечены и проанализированы для расчета их средней площади, длины периметра и количества на ячейку в указанное время. Эти атрибуты предоставляют важную информацию о биологии хламидийных включений, в том числе о том, как они взаимодействуют с клеткой-хозяином. Здесь показано видео с клетками вишни, инфицированными GFPC, Tracom L two, состоящим из покадровых изображений, сделанных с интервалом в пять минут в течение 125 минут, начиная с 48 часов после заражения.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать этот метод обратной визуализации не только для визуализации хламидийных включений, но и для количественной оценки динамики включений, такой как периметр зоны включения и количество включений на клетку. Этот метод экономически эффективен по сравнению с более традиционными методами визуализации и работает со всеми видами и штаммами хламидий.