Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации и количественной оценке динамики роста включений хламидий в живых клетках. Это достигается путем первоначального создания флуоресцентных клеток-хозяев, которые стабильно экспрессируют флуоресцентный белок, такой как GFP, в своей цитоплазме. Затем клетки-хозяева инфицируют хламидиями и инкубируют.

Затем инфицированные клетки визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии живых объектов. В завершение характеристики включений хламидий количественно определяют с помощью программного обеспечения для анализа микроскопических изображений; таким образом, флуоресцентная микроскопия живых объектов используется для визуализации включений хламидий внутри клетки-хозяина и измерения биологических параметров этих включений для получения количественных результатов. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими способами, такими как подсчет на основе антител, являются возможность применения этой стратегии обратного имиджинга на живых клетках, а также возможность ее совместного использования с другими флуоресцентными метками для количественной оценки динамики включений всех видов хламидий.

Кроме того, в отличие от стандартных методов, при которых маркируются бактерии внутри клеток, данный подход позволяет визуализировать мембрану включения в живых клетках и, таким образом, выявить важные динамические свойства этого компартмента, содержащего патоген. После получения флуоресцентных клеток HeLa, согласно текстовому протоколу, высейте клетки HeLa, экспрессирующие GFP, в подходящий культуральный сосуд, например, в чашки с стеклянным дном для получения изображений высокого разрешения или в 24-луночные планшеты для определения единиц инфекционности (IFU) и многолуночного скрининга; разморозьте на льду пробирку с замороженным штаммом C. trachomatis или любым другим желаемым штаммом хламидий и разведите в HBSS до необходимой множественности заражения. Для проведения статического заражения штаммом C. trachomatis LGV zero VL two аспирируйте среду из лунок и промойте клетки HeLa, экспрессирующие GFP, используя HBSS.

Добавьте разведенную суспензию бактерий в лунки и инкубируйте при 25 °C в течение двух часов, затем аспирируйте клетки и промойте их раствором HBSS. После добавления ростовой среды инкубируйте клетки при 37 °C в CO₂-инкубаторе для проведения инфекции с помощью центрифугирования штаммом crich серовара D или любым другим штаммом хламидий. Используйте HBSS для промывки клеток HeLa, экспрессирующих GFP, и добавьте к клеткам разведенную суспензию бактерий.

Затем поместите чашку с инфицированными клетками в многолуночный адаптер ротора с поворотными стаканами настольной центрифуги. Центрифугируйте клетки при 900 ×g и 25 °C в течение одного часа. Затем поместите культуральные сосуды в CO2-инкубатор при 37 °C на один час в боксе биологической безопасности, аспирируйте клетки, дважды промойте их раствором HBSS и добавьте ростовую среду.

Инкубируйте чашку с инфицированными клетками при 37 °C. Чтобы визуализировать включения хламидий, извлеките инфицированные хламидиями GFP-клетки HeLa из инкубатора с углекислым газом и используйте среду RPMI без фенолового красного с 5% FBS для замены среды. Поместите чашку или многолуночный планшет на инвертированный флуоресцентный микроскоп с масляным объективом с увеличением 20х или выше. С помощью программного обеспечения для визуализации идентифицируйте инфицированные хламидиями GFP-клетки HeLa, которые выглядят как зеленые клетки, содержащие крупные черные полости.

В диалоговом окне настроек сбора данных настройте программное обеспечение для получения изображений в зеленом канале и любых других каналах, добавленных в образец. Используйте кнопку захвата/записи (capture/record) для получения изображений в нужные моменты времени. После инфицирования извлеките из инкубатора чашку с клетками HeLa GFP, инфицированными хламидиями, и поместите ее на инвертированный флуоресцентный микроскоп.

Сфокусируйтесь на срединной плоскости клеток, где включения имеют максимальный диаметр и выход. При четких краях объектов сделайте снимки как минимум в 10 полях зрения на каждую лунку. Лунки обычно представляют собой повторности или экспериментальные переменные.

Чтобы найти клетки HeLa, экспрессирующие GFP, на вкладке измерений (measurements), используйте команду поиска объектов (find objects) и выберите зеленый канал. Настройте порог интенсивности (threshold intensity) в зависимости от относительной интенсивности свечения клеток. Подсчитайте количество включений или черных компартментов, а также клеток HeLa GFP вручную на глаз или используйте алгоритмы программного обеспечения для анализа изображений для автоматического выявления и подсчета включений.

Отфильтруйте выбранные объекты, оставив только те, площадь которых превышает 5 µm². Обозначьте эту группу как популяцию один. Используя данную популяцию, примените команду «заполнение отверстий в объектах» (fill holes in objects), в результате чего будет сформирована популяция два.

Вычтите популяцию один из популяции два, чтобы получить положительно маркированные включения хламидий, обозначенные как популяция три. Используйте команду фильтрации популяции, чтобы применить фильтр по размеру к популяции три. Например, для включений в клетках, инфицированных в течение 24 часов или более, оставьте объекты размером более 25 квадратных микрометров; для ранних сроков инфекции установите фильтр размера так, чтобы оставить объекты более 4 квадратных микрометров.

Поскольку эти включения значительно меньше, фильтрация по размеру позволяет выделить популяцию объектов, определяемых как включения. Используйте программное обеспечение для анализа изображений, чтобы рассчитать количественные данные по снимкам, такие как количество включений, их размер и окружность. При инфицировании хламидиями включения легко видны в виде черных пятен и клеток-хозяев или экспрессирующих флуоресцентный белок хламидий внутри клеток-хозяев; их четкость может быть использована для автоматической идентификации во многих полях зрения и/или при различных вариантах обработки.

Как показано на данном графике, одним из основных применений является определение единиц, образующих включения хламидий в живых инфицированных клетках, что избавляет от необходимости проведения процедур иммунофлуоресценции, которые являются трудоемкими и дорогостоящими. Другой ключевой особенностью этого метода визуализации является возможность его легкого применения к любому виду или штамму chlamydia. В данном примере для каждого из четырех видов или штаммов хламидий был проведен анализ временного ряда клеток HeLa, экспрессирующих GFP и инфицированных соответствующим видом или штаммом.

Инклюзии маркировали и анализировали для расчета их средней площади, длины периметра и количества на клетку в указанные моменты времени. Эти характеристики предоставляют важную информацию о биологии хламидийных инклюзий, в том числе об их взаимодействии с клеткой-хозяином. Здесь представлено видео клеток HeLa, экспрессирующих mCherry и инфицированных GFPC Tracom L2, состоящее из серии изображений, полученных методом тайм-лапс с интервалом в 5 минут в течение 125 минут, начиная с 48 часов после инфицирования.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать данный метод обратного имиджинга не только для визуализации включений хламидий, но и для количественной оценки динамики включений, такой как площадь и периметр включения, а также количество включений на клетку. Этот метод является экономически эффективным по сравнению с более традиционными методами визуализации и применим ко всем видам и штаммам хламидий.