Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

Общая цель данной процедуры — наблюдение за флуоресцентно меченым бактериальным симбиозом внутри нематоды-хозяина. Это достигается путем предварительного мечения бактерий флуоресцентным белком с помощью конъюгации. Вторым этапом является выделение нематод AIC путем сбора яиц.

Затем нематоды AIC выращивают совместно с их флуоресцентно меченным бактериальным симбионтом, чтобы обеспечить естественное взаимодействие и, в конечном итоге, локализацию бактериального симбионта внутри нематоды-хозяина. Частоту этого взаимодействия в популяции нематод можно определить с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области симбиоза, такие как: где именно бактерии локализуются внутри хозяина и каково распределение бактериального носительства в популяции хозяев?

После ночного культивирования бактериальных штаммов перенесите донорский, реципиентный и хелперные штаммы в богатую питательную среду без антибиотиков в соотношении культуры к среде 1:100, затем культивируйте их при температуре, соответствующей каждому штамму, до достижения середины логарифмической фазы роста. Затем объедините штаммы в одной микроцентрифужной пробирке и центрифугируйте смешанные культуры в течение двух минут при 17 900 Gs, слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в 30 µL свежей среды. После этого нанесите суспензию каплей на чашку с богатой питательной средой без антибиотиков и дайте капле высохнуть.

Инкубируйте чашку в перевернутом виде в течение ночи при температуре, оптимальной для бактерии-реципиента и допустимой для донора и хелпера, если применимо. Затем снимите содержимое пятна и произведите посев штрихом на селективную антибиотикосодержащую среду для получения чистой культуры бактерий, выделив отдельную колонию. В завершение убедитесь, что полученные колонии являются симбионтом-реципиентом, а не донорским штаммом.

Путем скрининга на наличие специфических фенотипов реципиента. Например, бактерии cino abdi можно отличить от e coli, проведя катализационный тест; скрининг на наличие плазмиды проводится путем подтверждения флуоресценции при длине волны, соответствующей флуоресцентному белку плазмиды. После ночного выращивания натурального бактериального симбионта нанесите 600 µL бактериальной культуры на 8–10 чашек с липидным агаром диаметром 10 мм, затем инкубируйте планшеты в темноте без доступа влаги при 25 °C.

Через два дня добавьте 5 000 инфективных ювенильных нематод в 500 µL среды на бактериальные газоны. После инкубации планшетов при 25 °C в течение еще трех дней нанесите 20 µL воды на предметное стекло. Затем с помощью стерильной палочки соберите небольшое количество нематод с бактериального газона.

Поместите палочку в воду, чтобы нематоды могли уплыть. Осмотрите этот препарат под малым увеличением. Если видны яйца и самки, продолжайте процедуру, когда самки будут содержать яйца; налейте несколько миллилитров воды на поверхность планшетов, осторожно перемешайте содержимое круговыми движениями, а затем перелейте воду в коническую пробирку объемом 50 мл.

Нематоды должны покинуть чашки и больше не быть видимыми на их поверхности. Дайте нематодам осесть на дно пробирки, затем удалите излишки воды из верхней части пробирки с помощью пипетки и залейте в пробирку чистую воду. После того как взрослые нематоды осядут, снова удалите излишки воды пипеткой и заполните конические пробирки раствором яиц.

Затем перемешайте содержимое пробирок путем осторожного переворачивания в течение ровно 10 минут при комнатной температуре. После перемешивания немедленно центрифугируйте конические пробирки в течение ровно 10 минут при 1, 250 Gs и комнатной температуре с включенным тормозом. Затем быстро слейте супернатант, ресуспендируйте осадок в растворе яиц с помощью дозирования пипеткой и заполните коническую пробирку свежим раствором яиц.

Тщательно перемешайте суспензию яиц, перевернув пробирку три-пять раз, после чего немедленно осадите яйца центрифугированием и слейте супернатант, как показано выше. Ресуспендируйте осадок в бульоне misogyny или LB с помощью дозирования пипеткой, затем перенесите суспензию яиц в коническую пробирку объемом 15 мл. Заполните пробирку объемом 15 мл бульоном LB, трижды промойте яйца в бульоне, используя ту же технику быстрого осаждения, которая была продемонстрирована ранее, и затем разведите ресуспендированные яйца нематод P до концентрации не менее 10 яиц на 1 µL.

Перенесите яйца в чашку Петри диаметром шесть сантиметров, содержащую пять миллилитров среды LB и антибиотики против колонизирующих бактерий. Пластину можно хранить в обертке из парафиловой пленки до четырех дней после ночного роста и селекции флуоресцентных бактерий. С помощью стерильного стержня нанесите 600 µL бактериальной культуры на 10 мм липидные диски и инкубируйте культуру при 25 °C.

Через два дня распределите от 500 до 5 000 яиц нематод на каждую липидную чашку. Если чашка хранилась, перед инокуляцией яиц на предварительно подготовленные бактериальные газоны промойте яйца в 15 миллилитрах LB, как было продемонстрировано выше, по крайней мере один раз. Затем инкубируйте совместные культуры нематод и бактерий в темноте без избыточной влажности при 25 °C до появления инфективных ювенильных особей в виде пушистого белого кольца по краю чашки.

После обнаружения инфекционных ювенильных особей снимите крышку с чашки с липидным агаром и поместите дно чашки на дно пустой чашки Петри размером 100 мм на 20 мм. Затем наполните чашку Петри достаточным количеством воды, чтобы она доходила примерно до половины высоты меньшей чашки, и инкубируйте водную ловушку до тех пор, пока потомство инфекционных ювенильных особей не выйдет в воду.

После сбора нематод из воды или на нужной стадии жизненного цикла с соответствующего бактериального газона растворите несколько крупинок ole в 30 microliters воды и добавьте от одного до двух microliters этого парализующего агента на каждые 50 microliters образца нематод. Затем перенесите около 20–30 microliters парализованного образца нематод на предметное стекло и накройте образец покровным стеклом. Осмотрите нематод с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что они находятся в поле зрения.

Для определения локализации бактерий сфотографируйте нематод с помощью флуоресцентной микроскопии в дополнение к световой микроскопии, а затем наложите изображения друг на друга. Для обнаружения бактерий может потребоваться перебор нескольких вариантов увеличения и ракурсов обзора нематоды.

Популяции нематод из двух сред подсчитали и оценили по степени колонизации бактериальным симбионтом. Для получения достоверных статистических данных рекомендуется подсчитать не менее 100 нематод на образец, при этом не менее 30 особей должны попадать в каждую категорию, как показано в таблице. Уровень колонизации этих нематод составляет примерно 14,6% при выращивании на липидном агаре и 68,6% при выращивании на агаре с печенью и почками.

Было показано, что другие виды нематод и бактерий обладают разным уровнем колонизации. На этой схеме представлен общий вид самок Steiner NEMA. На вставке показано изображение самки S fot, полученное с помощью дифференциального интерференционного контраста при 20-кратном увеличении.

Черная стрелка на врезке указывает на вульву, в то время как белые стрелки указывают на видимые яйца. На этом изображении показано развитое, но не вылупившееся яйцо нематоды вольта при 40-кратном увеличении; данные яйца, выделенные из нематод вольта, были сфотографированы при 10-кратном увеличении. На этом первом изображении представлены репрезентативные микрофотографии нематод Steiner Nima, ассоциированных с бактериями Xeno aptus.

Для создания этого композитного изображения нематоды Alvin's были совмещены с их бактериальным симбионтом expo, экспрессирующим GFP. Изображение, полученное с помощью фазово-контрастной микроскопии, было наложено на флуоресцентное изображение. Стрелка указывает на бактерии, находящиеся внутри инвазионной личинки нематоды.

На данном изображении представлена личинка нематоды S carpa capsi с GFP-экспрессирующим X nla. Изображение было создано аналогичным образом, как и предыдущее; на нем видна личинка нематоды с бактериями, меченными зеленым флуоресцентным белком, которые представлены в виде зеленых палочек, локализованных в просвете кишечника нематоды. В дополнение к описанной процедуре могут быть применены другие методы, такие как генетическая манипуляция бактериальным симбионтом перед его ассоциацией с нематодой-хозяином, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о молекулярных механизмах, необходимых для ассоциации хозяина и микроба.