Визуализация Бактерии в Нематоды использованием флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении флуоресцентно меченых бактериальных симбиентов внутри их хозяина-нематоды. Это достигается путем предварительного мечения бактерий флуоресцентным белком с помощью конъюгации. Вторым шагом является изоляция нематод AIC путем сбора яиц.

Затем нематоды AIC выращиваются в сочетании с их флуоресцентно меченным бактериальным симбиантом, чтобы обеспечить естественную ассоциацию, в конечном счете, локализацию бактериального симбианта внутри хозяина нематоды. А частота этой ассоциации в популяции нематод может быть определена с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области симбиоза, например, где бактерии локализуются в организме хозяина и каково распределение бактериального носительства в популяции хозяина?

После ночного роста бактериальных штаммов, субкультуры, донор-реципиент и хелпер превращают штаммы в богатые питательными веществами питательные среды, в которых отсутствуют антибиотики в соотношении культура к среде, затем выращивают культуры при температуре, подходящей для каждого штамма, до тех пор, пока они не достигнут средней стадии роста. Затем соедините штаммы в одной микроцентрифужной пробирке и центрифугируйте смешанные культуры в течение двух минут при 17 900 G, сцедите надосадочную жидкость и разбейте гранулу в 30 микролитрах свежей среды. Затем нанесите суспензию на богатую питательными веществами среду без каких-либо антибиотиков и дайте пятну высохнуть, когда суспензия высохнет.

Инкубируйте перевернутую пластину в течение ночи при температуре, оптимальной для бактерии-реципиента и допустимой для донора и помощника, если это применимо. Теперь соскребите пятно и полосу для отдельных колоний на селективной антибиотиковой пластине, чтобы получить чистую культуру бактериальной полосы, одну колонию для выделения. Наконец, убедитесь, что полученные колонии являются симбиантом реципиента, а не донорским штаммом.

Путем скрининга на наличие специфических фенотипов реципиента. Например, бактерии cino abdi можно отличить от кишечной палочки путем проведения каталитического теста, скрининга на наличие плазмиды путем подтверждения флуоресценции на длине волны, соответствующей флуоресцентному белку плазмиды. После выращивания натурального бактериального симбианта в течение ночи разбрасывают 600 микролитров бактериальной культуры на 8-10 10 миллиметровых липидных аэр, а затем инкубируют пластины в темноте без влаги при температуре 25 градусов Цельсия.

Через два дня добавьте 5 000 инфекционных ювенильных нематод в 500 микролитрах среды на бактериальные газоны. После инкубации планшетов при температуре 25 градусов Цельсия в течение еще трех дней поместите 20 микролитров воды на предметное стекло микроскопа. Затем используйте стерильную палочку, чтобы соскоблить небольшое количество нематод с бактериальной лужайки.

Опустите палочку в воду, чтобы нематоды уплыли. Посмотрите на эту горку при малом увеличении. Если видны яйца и самки, продолжайте, когда самки содержат яйца, налейте несколько миллилитров воды на поверхность пластин, осторожно покрутите пластины, а затем налейте воду в коническую трубку объемом 50 миллилитров

Нематоды должны оторваться от пластин и больше не быть видимыми на поверхности пластин. Дайте нематодам осесть на дно трубки, затем слейте лишнюю воду из верхней части трубки и снова наполните трубку чистой водой. Дав взрослым нематодам осесть и еще раз отпившись от лишней воды, заполните конические трубки яичным раствором.

Затем перемешайте пробирки путем мягкой инверсии ровно 10 минут при комнатной температуре. После встряхивания немедленно центрифугируйте конические пробирки ровно в течение 10 минут при температуре 1,250 G и комнатной температуре с включенным разрывом. Затем быстро сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу яичным раствором методом пипетирования и заполните коническую трубку свежим яичным раствором.

Хорошо перемешайте яичную суспензию, перевернув трубку от трех до пяти раз, а затем сразу же гранулируйте яйца и сцеживайте надосадочную жидкость, как показано только что на рисунке. Повторно суспендируйте гранулу в мизогинии, бульоне или LB с помощью пипетирования, а затем перенесите яичную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Теперь наполните 15-миллилитровую трубку фунтом, трижды промойте яйца в бульоне, используя ту же технику быстрого шага, что и только что продемонстрированная, а затем разбавьте яйца ресуспендированной P-нематоды по крайней мере до 10 яиц на микролитр.

Переложите яйца в шестисантиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров LB и антибиотики против колонизирующих бактерий. Планшет можно хранить завернутым в перфил до четырех дней после ночного роста и отбора флуоресцентных бактерий. Используйте стерильную палочку, чтобы распределить 600 микролитров бактериальной культуры на 10-миллиметровую липидную аэрацию и инкубировать культуру при температуре 25 градусов Цельсия.

Через два дня выдайте от 500 до 5000 яиц нематоды на каждую липидную пластину. Если тарелка хранилась, вымойте яйца в 15 миллилитрах LB, как показано только что по крайней мере, один раз, прежде чем прививать яйца на предварительно подготовленные бактериальные газоны. Затем инкубируйте бактерии нематоды в темноте без влаги при температуре 25 градусов Цельсия до тех пор, пока заразная молодь не появится в виде нечеткого белого кольца на краю пластины.

Когда заразная молодь была замечена. Снимите крышку пластины с липидным агаром и опустите дно пластины на дно пустой чашки Петри размером 100 на 20 миллиметров. Затем наполните чашку Петри достаточным количеством воды, чтобы она поднялась примерно на половину высоты меньшей тарелки, и инкубируйте водяную ловушку до тех пор, пока в воду не выйдет заразная молодь потомства.

После сбора нематод из воды или на желаемой стадии жизни с соответствующего бактериального газона, растворите несколько зерен оле в 30 микролитрах воды, а в одном-двух микролитрах этого парализующего агента на каждые 50 микролитров образца нематоды. Затем перенесите от 20 до 30 микролитров образца парализованной нематоды на предметное стекло микроскопа и поместите крышку сверху на образец. Наблюдайте за нематодами с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что нематоды находятся в поле зрения.

Для выявления бактериальной локализации. Сфотографируйте нематод под флуоресцентной микроскопией в дополнение к световой микроскопии, а затем наложите изображения. Возможно, потребуется попробовать несколько увеличений и видов нематоды, чтобы найти бактерии.

Популяция нематод из двух сред была подсчитана и оценена для колонизации бактериальным симбионтом. Для получения надежной статистики лучше всего насчитать не менее 100 нематод на образец, при этом не менее 30 нематод попадают в каждую категорию, как показано в таблице. Эти нематоды колонизируются на уровне примерно 14,6% при выращивании на липидном агаре и 68,6% при выращивании на печени, почечном агаре.

Было показано, что другие виды нематод и бактерий имеют разные уровни колонизации. Эта схема иллюстрирует общий вид самок Steiner NEMA. На врезке показано дифференциально-интерференционно-контрастное изображение самки S fot graphic при 20-кратном увеличении.

Черная стрелка на врезке указывает на вульву, тогда как белые стрелки указывают на видимые яйца. На этом изображении показано развитое, но не вылупившееся яйцо вольтовой нематоды при 40-кратном увеличении, и эти яйца, выделенные из нематод Volta, были изображены при 10-кратном увеличении. Здесь представлены репрезентативные микроскопические изображения нематод Steiner Nima, связанных с бактериями Xeno aptus, на этом первом изображении.

Нематоды Алвина были связаны с их бактериальным симбиантным экспо, экспрессирующим GFP, для создания этого составного изображения. На фазово-контрастное изображение накладывалось флуоресцентное изображение. Стрелка указывает на бактерии, присутствующие в инфекционной ювенильной нематоде.

На этом изображении показана молодая нематода S carpa capsi с GFP, экспрессирующей X nla. Изображение было построено таким же образом, как и предыдущее, и изображает молодую нематоду с зеленым флуоресцентным белком, меченным бактериями, визуализированными в виде зеленых палочек, локализованных по всему просвету кишечника нематоды. В дополнение к описанной процедуре могут быть включены другие методы, такие как генетическая манипуляция бактериальным симбиантом до ассоциации с хозяином-нематодой, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как каковы молекулярные механизмы, необходимые для ассоциации микроба-хозяина.