Живой клетки микроскопии флуоресцирования соблюдать основные процессы во время роста микробных клеток

Общая цель этого подхода, основанного на микроскопии, заключается в наблюдении за центральными процессами во время роста бактериальных клеток. Этот метод позволяет нам решать важные вопросы бактериологии, такие как координация основных процессов во время роста и деления бактериальных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем использовать флуоресцентные реагенты для визуализации поверхностей и структур бактериальных клеток в живых клетках.

В данной статье мы используем этот метод, чтобы получить представление об основных процессах в Agrobacterium tumefaciens. Тем не менее, этот процесс также может быть адаптирован к другим бактериям для изучения их роста. Для начала используйте стерильную деревянную палочку или наконечник для пипетки, чтобы ввести три миллилитра питательной среды ATGN в одну колонию дикого типа или мутантного штамма A.Tumifaciens.

Выращивайте культуру при температуре 28 градусов по Цельсию и 225 оборотах в минуту в течение ночи. На следующий день используйте спектрофотометр для измерения OD600. Затем разбавьте клеточную культуру до OD600, равного приблизительно 0,2, и продолжайте выращивать клетки до OD600, равного 0,6.

Распределите один миллилитр экспоненциальной культуры в три пробирки с микрофугами. И гранулируйте клетки в настольной центрифуге при давлении 7 000 x g в течение пяти минут. Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в одном миллилитре PBS, а затем добавьте либо один микролитр стокового раствора DMSO Orange, либо стокового раствора DAPI.

Аккуратно перемешайте с помощью пипетирования и инкубируйте повторно взвешенные клетки в темноте в течение пяти минут. Гранулируйте клетки центрифугированием при 7000 x g в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS для удаления избытка реагента. Затем промойте клетки еще два раза, и повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах PBS или средней.

Для одновременной покадровой визуализации объедините десять микролитров клеток из каждой процедуры в новой микропробирке. Чтобы подготовить агарозные подушечки для визуализации клеток, используйте покровный лист в качестве ориентира и разрежьте квадрат лабораторной пленки размером 22 на 22 миллиметра, проведя скальпелем по краям. Вырежьте квадрат из центра лабораторной пленки, оставив примерно двух-пятимиллиметровую границу, которая будет служить прокладкой для агарозной прокладки.

Затем выбросьте вырез по центру. Поместите пленочную прокладку на предметное стекло, очищенное нашатырным спиртом и чистящим средством, не содержащим спирта. И используйте нагревательный блок, установленный на 70 градусов по Цельсию, или пламя для нагрева предметного стекла до тех пор, пока пленка слегка не расплавится на стекле.

Далее приготовьте раствор агарозы, смешав в небольшой колбе примерно 0,075 грамма агарозы и пять миллилитров среды. Нагрейте раствор в микроволновой печи с периодическим вращением для перемешивания, пока агароза не растворится и раствор не станет прозрачным. Держите раствор агарозы при температуре 55-70 градусов Цельсия и используйте его для изготовления нескольких агарозных прокладок в течение 48 часов.

Пипеткой введите теплую агарозную среду в центр прокладки. Затем наденьте на прокладку крышку, чтобы равномерно распределить агарозу. Поместите предметное стекло на прохладную ровную поверхность, чтобы она застыла примерно на две минуты.

Теперь осторожно сдвиньте чехол с агарозной подушечки, затем дайте агарозной подушечке высохнуть на воздухе в течение одной-двух минут при комнатной температуре, пока поверхность прокладки не станет сухой. Правильная конструкция агарозного блокнота имеет решающее значение для получения высококачественных изображений. Не пытайтесь создавать изображения на плохом блокноте.

Если агарозная подушечка подсыхает, рябит или рвется, лучше не лениться и вместо этого сделать новую подушечку. Затем с помощью скальпеля удалите небольшую полоску агарозы, чтобы создать воздушный карман размером примерно два на семь-десять миллиметров. Клетки A.Tumefacien, как правило, лучше всего растут вблизи воздушного кармана.

Нанесите на агарозную подушечку от 0,8 до 1 микролитра клеток. Затем аккуратно наденьте защитный лист на верхнюю часть агарозной подушечки, чтобы распределить ячейки по поверхности подушечки. Для долговременной покадровой съемки используйте расплавленный Valap, чтобы запечатать края покровного стекла.

Обязательно загерметизируйте по всем краям и углам покровного стекла Valap. Невыполнение этого требования может привести к смещению во время цейтраферной съемки на агарозной прокладке. Чтобы провести эпифлуоресцентную микроскопию, нанесите иммерсионное масло на нужный объектив и поместите перевернутый предметный предмет в держатель предметного стекла на сцене.

Используйте ручки фокусировки, чтобы сфокусировать ячейки. Получайте изображения в фазовом режиме, или DIC и флуоресценции, используя нужный флуоресцентный фильтр для флуоресцентных изображений. При желании можно получить несколько позиций x, y, случайным образом выбрав десять полей клеток в непосредственной близости от воздушного кармана агарозных подушечек.

Настройте получение временной последовательности для получения изображения в фазе (DIC) в нужном интервале времени. Как показано здесь, клетки были визуализированы непосредственно из культуры после промывки центрифугированием, и после инкубации клеток с 0,1% ДМСО, результаты показали, что ДМСО сам по себе не влияет на морфологию клеток. Как Orange, так и DAPI мечут ДНК в живых клетках A.Tumefaciens.

В клетках с поздним периодом до деления при окрашивании оранжевым цветом наблюдаются два различных нуклеолоида, в то время как маркировка ДНК кажется более диффузной при окрашивании DAPI. В этом покадровом эксперименте с равной долей немеченных, меченных DAPI и меченных оранжевым цветом дикого типа A.Tumefaciens, все клетки выросли при визуализации с помощью фазово-контрастной микроскопии, что указывает на то, что ни одно из окрашиваний не нарушает рост клеток. Клетки также выросли под действием фазового контраста в эпифлуоресцентной микроскопии с использованием фильтра TRITC.

Однако при визуализации с помощью фильтра DAPI клетки перестали расти в течение часа. Следуя аналогичным методам, другие флуоресцентные реагенты также могут быть использованы для визуализации клеточной стенки или мембран бактерий. Кроме того, многие из этих флуоресцентных красителей могут быть объединены для получения полного изображения поверхности бактериальной клетки.

Визуализация сущностных процессов у живых бактерий является захватывающей задачей, поскольку открывает возможность изучения этих процессов у условных мутантов или немодельных бактерий. Это позволяет нам улучшить наши исследования различных видов бактерий.