Индукция инвазивная карцинома Переходные мочевого пузыря в иммунных интактными человеческими MUC1 трансгенных мышах: модель для иммунотерапии развития

Общая цель данного эксперимента заключается в том, чтобы эффективно индуцировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, нацеленный на опухолеассоциированный антиген при раке мочевого пузыря. Это достигается за счет индуцирования рака мочевого пузыря у мышей, экспрессирующих человеческий опухолеассоциированный антиген Mach One. Затем мышам вводят пептидную вакцину и генерируют один специфический цитотоксический ответ Т-лимфоцитов.

Затем изолируют сывороточную опухоль и селезенку, а ткани анализируют на цитокины, антигены и иммунный ответ соответственно. Использование мультиплекса вестерн-блоттинга, флюорометрических микрогранул, иммуногистохимического анализа и анализа живых пятен позволяет нам проверить эффективность пептидной вакцины против рака мочевого пузыря. Здравствуйте, я доктор Грегори Ветц, научный сотрудник Калифорнийского университета в Системе здравоохранения Дэвиса в Сакраменто, штат Калифорния.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как ксенотрансплантаты, заключается в том, что для ксенотрансплантатов требуются иммунокомпрометированные хозяева, в то время как в нашей модели используется иммунно интактная трансгенная мышь, которая экспрессирует человеческий опухолеассоциированный антиген, который является мишенью пептидной вакцины. Вместе со мной методы будут демонстрировать Даниэль V и доктора Чага и Одри Гутьеррес, все они являются коллегами-исследователями, а также лабораторией доктора Майкла де Грегорио и системой здравоохранения Калифорнийского университета в Дэвисе. Перед введением первой дозы N бутила, N четырех гидрокси, бутилнитрозамина или O-H-B-B-N для индуцирования рака мочевого пузыря проведите подчелюстное кровотечение у каждой мыши, чтобы собрать цельную кровь и пробирки для свертывания крови, и дайте 30 минут, чтобы кровь свернулась.

Начиная с восьми недель использования игл из нержавеющей стали 20 калибра, вводите O-H-V-B-N перорально пять дней в неделю в течение 12 недель. На 20-й неделе используйте 600 микролитров 0,9% стерильного физиологического раствора для восстановления каждого флакона лиофилизированной пептидной вакцины и тщательно ресуспендируйте, пропустив раствор через иглу диаметром 0,5 дюйма 27 калибра шесть раз с использованием физиологического раствора. Отрегулируйте концентрацию таким образом, чтобы желаемая доза была введена в объеме 100 микролитров после последней дозы O-H-B-B-N, и вводите вакцину еженедельно в течение восьминедельного цикла, используя иглу 25 калибра для введения 100 микролитров вакцины через восемь недель после последней дозы O-H-B-B-N.

После усыпления всех мышей с помощью удушения углекислым газом, поместите каждую мышь на доску для вскрытия и прикрепите все четыре конечности. Далее с помощью щипцов и ножниц сделайте горизонтальный разрез в верхней части живота. Вставьте ножницы в разрез между эпидермальным слоем и брюшной стенкой, и с помощью щипцов аккуратно отделите кожу от подлежащих тканей.

Сделайте вертикальный разрез от горизонтального разреза по средней оси к переднему концу мыши. Затем отделите кожу от грудной клетки и с помощью одномиллилитрового шприца и иглы 22 калибра проколите сердце и соберите кровь плавным и устойчивым забором с помощью щипцов и ножниц. Разрежьте и снимите оставшуюся часть эпидермального слоя внутри шкафа биологической безопасности.

Разрежьте брюшную стенку и брюшину и асептически. Удалите опухоль мочевого пузыря для иммуногистохимии или ИГХ и вестерн-блоттинг для ИГХ. Поместите образец опухоли мочевого пузыря в тканевую кассету и зафиксируйте его в охлажденном формине на ночь.

При комнатной температуре соберите селезенку для анализа жизнеспособности клеток и место лежания для проведения мультиплексного флюорометрического иммуноферментного анализа микробов. Используйте 200 микролитров буфера для предварительного увлажнения. Нижняя пластина фильтра на 96 лунок, позволяющая фильтру полностью пропитаться.

Затем с помощью вакуумного аппарата на 96 лунок аккуратно слейте воду из фильтра и с помощью бумажных полотенец высушите кровью дно пластины с помощью многоканальной пипетки, пипеткой 25 микролитров сыворотки матрицы в лунки, предназначенные для заготовок и стандартов, и пипеткой 25 микролитров пробирного буфера в лунки, предназначенные для контроля и неизвестных. Далее пипетка 25 микролитров заготовки эталонов, контрольных и неизвестных в соответствующие назначенные лунки. Перемешайте смесь в течение 20 секунд и переложите бусины в резервуар.

Затем нанесите пипеткой по 25 микролитров смеси шариков в каждую. Хорошо накройте тарелку, чтобы защитить ее от света, и встряхните тарелку на шейкере при 500 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре, слейте воду из тарелки и используйте 200 микролитров PBST, чтобы промыть ее дважды, прежде чем слить воду и промокать насухо. Чтобы приготовить раствор для обнаружения антител, соедините необходимое количество 0,1% PBST и антитела для обнаружения в пробирке объемом 15 миллилитров и сделайте вихрь в течение 10 секунд.

Затем пипетку по 25 микролитров в каждую. Хорошо встряхните тарелку при 500 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. Затем слейте воду и промойте пластину с 200 микролитрами 0,1%-ного PBST, дважды слейте и промокните сухим пипеткой по 25 микролитров свежеприготовленного стрептококка, AVID и FICO eryn или SAPE на каждую, хорошо поместите пластину на шейкер для тарелок и выдержите 30 минут при комнатной температуре при 500 об/мин.

Слейте воду и промойте PBST дважды. Чтобы суспензировать шарики, добавьте в каждую лунку по 100 микролитров 0,1% PBST и встряхивайте при 500 об/мин не менее двух минут. Используйте аппарат Luminex LX 200 для считывания и анализа пластины в шкафу биологической безопасности.

Обработайте мышиную селезенку через 100 микрометровые нейлоновые тканевые сита в пять миллилитров стерильного PBS в стерильных чашках Петри. Нанесите PLE aytes на три миллилитра среды для разделения лимфоцитов в стерильных 15-миллилитровых пробирках. Центрифугируйте пробирки при давлении 600 GS в течение 15 минут.

Чтобы отделить лимфоциты от эритроцитов, перенесите слоистые лимфоциты выше градиента в новые стерильные 15-миллилитровые пробирки в 1,5-миллилитровых центрифужных пробирках с винтовой крышкой. Используйте реагент для обеспечения жизнеспособности countin для серийного разведения лимфоцитов. Затем анализируйте на музе.

Подготовьте планшет с картой образцов и условий для контактной пластины, подготовив планшет в соответствии с протоколом производителя и пипеткой по 100 микролитров среднего пептида или пептида скрембла в каждую. Ну и добавьте 100 микролитров клеточной суспензии и инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Следуйте протоколу производителя для анализа пятна ALI и используйте диссекционный микроскоп для анализа разработанной пятнистой пластины Aly.

Количественно оцените результаты, подсчитав количество цветных пятен, соответствующих каждому аналиту в каждой лунке. Пятна соответствуют количеству пятнообразующих клеток в каждой лунке в нашей трансгенной модели мышиной индукции химическим канцерогеном. O-H-B-B-N приводил к высокой частоте случаев рака мочевого пузыря преимущественно переходно-клеточной карциномы или ТКК с некоторыми плоскоклеточными карциномами или ПКК, что похоже на рак мочевого пузыря у людей, как показано на этом рисунке.

Через восемь недель после индукции O-H-B-B-N частота заболеваемости раком мочевого пузыря как у трансгенных мышей или мышей дикого типа, так и у мышей дикого типа составила 67%. Окрашивание гематином и эозином подтвердило наличие как ТКК, так и ПКК с преобладанием ТКК в соотношении два к одному. Среди них мы наблюдали ряд неинвазивных и высокодифференцированных инвазивных опухолей высокой степени злокачественности. Все образцы рака мочевого пузыря Mach one были положительными на экспрессию Mach One с помощью IHC.

Во время разработки модели уровни воспалительных цитокинов в сыворотке крови контролировались последовательно с восьмой по 28-ю недели. Мы заметили, что уровни воспалительных цитокинов увеличивались с течением времени от индукции до конца исследования. Эта картина цитокинов очень похожа на то, что мы наблюдали ранее в нашей модели рака легких, что убедительно свидетельствует о том, что повышение уровня воспалительных цитокинов может коррелировать с развитием опухоли.

Для оценки сывороточного цитокинового ответа на пептидную вакцину 15 вакцинированных и 14 мышей, получавших плацебо, были усыплены, а кровь была собрана в конце исследования через 24 часа после последнего лечения вакциной. Мультиплексный анализ показывает повышенные уровни ФНО, альфа, интерферона гамма, ИЛ, 12 и ИЛ17 в группе вакцины, в одной сыворотке крови.

По сравнению с группой плацебо, уровни ФНО, альфа, интерферона, гамма и IL 17 были значительно выше у мышей, получавших вакцину. Эти результаты позволяют предположить поляризованный цитокиновый ответ на пептидную вакцину с целью оценки иммунного ответа TH один, TH два на пептидную вакцину. СП циты оценивали с помощью интерферона гамма, IL четыре пятна ОЛ, показанное здесь является оценкой выделенных лимфоцитов на жизнеспособность после посева ОЛП пятенчатых пластин с жизнеспособными лимфоцитами, результатами в данном эксперименте явился четкий и специфичный ответ интерферона гамма на пептид, что подтверждает ТН один иммунный ответ на пептидную вакцину после ее разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии рака к изучению новых иммунотерапевтических средств с использованием доклинической модели распространенного рака мочевого пузыря.