ECM Белковые Нановолокон и наноструктуры Инженерная Использование Поверхность по инициативе Ассамблеи

Общая цель этой процедуры заключается в создании отдельно стоящих нановолокон, наноструктур и 2D-матриц из одного или нескольких белков внеклеточного матрикса с использованием поверхностной сборки. Это достигается путем предварительной подготовки поли-диметилсоана или штампов PDMS путем заливки предварительного полимера PDMS на мастер-форму с топографическим рисунком и предоставления ему возможности отверждения. Второй шаг заключается в вырезании отвержденных штампов PDMS и покрытии их раствором, содержащим нужные белки внеклеточного матрикса.

Затем штампы промываются, сушатся и печатаются на микроконтакте на полипропилакриламиде или на стеклянной крышке с покрытием PAM. Заключительным этапом является увлажнение покровного стекла теплой деионизированной водой с температурой 40 градусов Цельсия и постепенное охлаждение восстанавливающегося раствора. Температура ниже 32 градусов Цельсия вызывает растворение термочувствительного слоя трубки PAM и высвобождение собранных белковых нановолокон или наноструктур.

В конечном счете, собранные нановолокна и наноструктуры являются автономно стоящими в растворе, что подтверждено фазовым контрастом и/или флуоресцентной микроскопией, и могут быть использованы в других приложениях, таких как тканевая инженерия. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как разделение лица или электроспиннинг, является возможность конструировать нановолокна белка ECM с использованием метода, который действительно имитирует способ, которым клетки обычно строят волокна ECM in vivo. Метод поверхностной сборки имеет ряд уникальных преимуществ, в том числе возможность контролировать состав белка, морфологию волокон и архитектуру каркаса.

Кроме того, мы можем сконструировать нановолокна белка ECM из белков внеклеточного матрикса, таких как ламинат волокна нин и коллаген четвертого типа, что оказалось сложным при использовании других методов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, позволяя исследователям разрабатывать конструкции со специфическими и четко определенными физическими и химическими сигналами для управления различными формами поведения клеток, такими как адгезия и дифференцировка. Если вы новичок в этой технике, вы должны не забывать постоянно проверять качество ваших стеблей, а также точность шаблонов с микроконтактной печатью.

Это необходимо для получения правильной сборки нановолокон и наноструктур ECM. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте поли-диметилсоан или предварительный полимер PDMS, комбинируя эластомерную основу и отвердитель в соотношении 10 к одному весу к весу, обычно используют 80 граммов основания и восемь граммов отвердителя, чтобы обеспечить достаточное количество PDMS для покрытия мастер-формы смесью толщиной в один сантиметр и DGA PDMS с помощью центростремительного миксера, установленного на следующую смесь при 2000 об/мин в течение двух минут, DGA при 2000 об/мин в течение двух минут. Достаточно бедно.

PDMS предварительно полимером над мастер-формой для формирования слоя толщиной в один сантиметр здесь, PDMS путем запекания при температуре 65 градусов Цельсия в течение четырех часов. После отверждения с помощью скальпеля вырежьте область, содержащую узор, чтобы сформировать штамп PDMS. Чтобы отличить характерную сторону от оборотной стороны штампа PDMS.

Вырежьте выемку в одном из углов на обратной стороне штампа. Начните эту процедуру с очистки стеклянных покровных стекол диаметром 25 миллиметров, обработайте их ультразвуком в 95% этаноле в течение одного часа, а затем высушите их в духовке при температуре 65 градусов Цельсия. Далее приготовьте поли и изопропилакриламид или раствор пиама, растворите пиам в одном бутаноле в концентрации 10%Центрируйте чистое стекло, наденьте на вакуумный патрон спиновой коэр и пипеткой нанесите 200 микролитров трубки раствора Пам на стеклянную поверхность, чтобы покрыть поверхность целиком.

Отжимайте защитный лист при 6 000 об/мин в течение одной минуты. Очистите штампы PDMS с помощью ультразвука в 50% этаноле в течение 30 минут, а затем высушите под потоком азотной сушки, а все последующие шаги следует выполнять в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности для применений, где внеклеточный матрикс или наноструктуры ECM будут использоваться с клетками. Этап микроконтактной печати является самым сложным аспектом этой процедуры.

Перед использованием важно проверить штампы PDMS на наличие видимых дефектов. Также не стоит использовать белковый раствор, который старше двух недель места. Крышка с покрытием PIAM помещается внутрь закрытой чашки Петри и стерилизуется под воздействием ультрафиолета.

Достаточно 45 минут под ультрафиолетовым светом в шкафу биобезопасности. Покройте поверхность рисунка каждого штампа PDMS 200 микролитрами белкового раствора. Здесь используется фибронектин или ФН в концентрации 50 микрограмм на миллилитр в стерильной дистиллированной воде.

Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре, через час промыть штампы PDMS и дистиллированную воду для удаления излишков белка и тщательно высушить под струей азота. Важно полностью удалить воду, чтобы избежать преждевременного растворения трубы. Налет Пам на покровном скольжении и неправильный перенос белка.

При необходимости выполните микроконтактную печать, поместив характерную сторону штампа PDMS в контакт с покровным листом трубы с покрытием PAM. С помощью щипцов слегка постучите по обратной стороне штампов, чтобы удалить пузырьки воздуха и обеспечить равномерный контакт через пять минут. Отклейте штамп PDMS от покровного листа.

На данном этапе. В зависимости от исследования, дополнительные белки ECM могут быть смоделированы для создания более сложных и многокомпонентных структур. После печати шаблона ECM поместите шаблон трубки с покрытием PAM в чашку Петри диаметром 35 мм и проверьте точность шаблона с помощью фазово-контрастной микроскопии.

В зависимости от рисунка может потребоваться ПЗС-камера для разрешения особенностей рисунка. Флуоресцентная микроскопия также может быть использована для изучения рисунка при условии, что белки ECM флуоресцентно помечены. После проверки правильности рисунка добавьте в чашку Петри три миллилитра дистиллированной воды с температурой 40 градусов Цельсия и дайте воде постепенно остыть растворение трубы.

Слой PAM и высвобождение белковых паттернов ECM можно контролировать с помощью фазово-контрастной микроскопии. Как правило, для того, чтобы обеспечить высвобождение белковых наноструктур ECM, воду охлаждают до комнатной температуры, значительно ниже нижней критической температуры раствора в трубе, pam, которая составляет 32 градуса Цельсия. Если применение не позволяет использовать оптические методы, высвобождение можно контролировать путем измерения температуры раствора.

Нановолокна и другие наноструктуры будут плавать в воде после высвобождения слоя PAM в трубе. Для дальнейших применений необходимо манипулировать нанотканями и другими наноструктурами, но точный подход будет зависеть от цели эксперимента. Здесь представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие, что поверхностная инициируемая сборка или SIA способна создавать нановолокна белка ECM с точным контролем размеров волокон.

Массив прямоугольников фибронектина длиной 50 микрометров и шириной 20 микрометров был нанесен на покрытое покрытием покрытие пиамом с добавлением воды под 40 градусов Цельсия и последующим охлаждением ниже нижнего критического раствора. Температура пиама вызывала растворение пиама и высвобождение нановолокон фиброина при высвобождении. Волокна сжимались, потому что находились под внутренним предварительным напряжением.

При нанесении на поверхность пиама анализ размеров нановолокон фибронектина перед высвобождением показал, что они были монодисперсными со средней длиной 50,19 плюс-минус 0,49 микрометра и средней шириной 19,98 плюс-минус 0,17 микрометра. При высвобождении нановолокна заметно сокращались, но оставались монодисперсными со средней длиной 14,15 плюс-минус 0,92 мкм и средней шириной 2,65 плюс-минус 0,32 мкм. Атомно-силовая микроскопия обеспечила перспективу с более высоким разрешением для изменения размеров волокон, связанных с процессом высвобождения SIA.

Примечательно, что волокна до высвобождения имели равномерную толщину около пяти нанометров, в то время как волокна после высвобождения имели толщину порядка нескольких сотен нанометров, в то время как длина и ширина уменьшались. Используя процесс SIA, можно создавать различные белковые наноструктуры ECM с настраиваемым размером, формой и составом. Например, нановолокна фибронектина первоначально 20 микрометров в ширину и один сантиметр в длину были нанесены на трубку.

Крышка с покрытием PAM скользит при охлаждении и трубе. При растворении Пам нановолокна высвобождались, образуя длинные нити с уменьшенной шириной около трех микрометров. Кроме того, поскольку рисунок определяется топографией поверхности штампа PDMS, используемого для микроконтактной печати, можно спроектировать сложные белковые наноструктуры ECM в качестве доказательства концепции.

Были созданы многоплечие фиброиновые звезды. Тепловое выделение привело к сжатию рукавов, но не центральной области звезды, где рукава соединялись вместе. SIA также работает с другими белками ECM, такими как laminate или LN, и несколько белков ECM могут быть включены в одну структуру.

В этом примере ортогональные взаимосвязанные линии фибронектина шириной 20 микрометров, показанные красным цветом, и линии ламинина шириной 50 микрометров, показанные зеленым цветом, интегрированные в 2D-наноткань, были структурированы, а затем высвобождены после высвобождения, оба типа нановолокон сократились, но общая взаимосвязанность и квадратная структура решетки были сохранены. Эти результаты демонстрируют, что SIA может быть использован для разработки материалов ECM с различными составами и структурами. Наконец, показаны некоторые примеры неудачной SIA нановолокон ECM.

Одной из причин является неправильное высвобождение неполного рисунка из-за плохого переноса белка ECM на поверхность пиама. При микроконтактной печати наличие отверстий, неровных краев и других дефектов приведет к созданию нановолокон и наноструктур, которые будут неполными и склонными к разрыву и фрагментации при высвобождении. Быстрое растворение трубки PAM также может привести к низкой точности рисунка после освобождения.

Например, используя воду с температурой 20 градусов по Цельсию, температуру уже ниже нижнего критического раствора. Температура пиама приведет к тому, что пиам быстро набухнет и растворится. Это может привести к тому, что нановолокна будут отламываться и разрываться, как показано на 32-м изображении, и образовывать случайные неорганизованные конфигурации, как показано на 52-м изображении.

Перед началом этой процедуры проверьте состояние PDMS на наличие дефектов, а также убедитесь, что все поверхности очищены от пыли. В противном случае это будет препятствовать правильному переносу белка и приведет к плохой сборке структур А КМ. Таким образом, после этой процедуры, высвобождающие нановолокна или наноструктуры могут быть использованы для выполнения ряда задач, таких как анализ механических свойств белковых волокон, или использоваться в качестве каркасов для тканевой инженерии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проектировать нановолокна и наноструктуры белков ECM с настраиваемым составом, геометрией и архитектурой. В частности, вы должны понимать, как наносить микроконтактную печать белков ECM на стеклянные покровные стекла с покрытием из питона, а затем термически запускать растворение поверхности для сборки структур ECM.