ECM Белковые Нановолокон и наноструктуры Инженерная Использование Поверхность по инициативе Ассамблеи

Общая цель данной процедуры заключается в создании свободностоящих нановолокон, наноструктур и 2D-матриц из одного или нескольких белков внеклеточного матрикса с помощью сборки, инициируемой на поверхности. Это достигается путем предварительного изготовления штампов из полидиметилсилоксана (PDMS) путем заливки преполимера PDMS в мастер-форму с топографическим рисунком и последующего отверждения. На втором этапе вырезают отвержденные штампы PDMS и покрывают их раствором, содержащим необходимые белки внеклеточного матрикса.

Затем штампы промывают, высушивают и наносят методом микроконтактной печати на стеклянное покровное стекло, покрытое поли-N-изопропилакриламидом, или pNIPAM. Заключительным этапом является гидратация покровного стекла теплой деионизированной водой при 40 °C с последующим постепенным охлаждением раствора. Снижение температуры примерно до 32 °C вызывает растворение термочувствительного слоя pNIPAM и высвобождение собранных белковых нановолокон или наноструктур.

В конечном итоге собранные нановолокна и наноструктуры остаются свободно взвешенными в растворе, что подтверждается фазово-контрастной и/или флуоресцентной микроскопией, и могут быть использованы в дальнейших приложениях, таких как каркасы для тканевой инженерии. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как разделение фаз или электроспиннинг, является возможность конструирования нановолокон из белков внеклеточного матрикса (ECM) с помощью метода, который максимально точно имитирует естественный процесс сборки волокон ECM клетками in vivo. Метод сборки, инициируемой на поверхности, обладает рядом уникальных преимуществ, включая возможность контроля белкового состава, морфологии волокон и архитектуры каркаса.

Кроме того, мы можем создавать нановолокна из белков внеклеточного матрикса (ВКМ), таких как фибронектин, ламинин и коллаген IV типа, что оказалось затруднительно при использовании других методов. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, позволяя исследователям разрабатывать конструкции со специфическими и четко определенными физическими и химическими сигналами для управления различными аспектами поведения клеток, такими как адгезия и дифференцировка. Если вы только начинаете осваивать эту технику, не забывайте постоянно контролировать качество ваших стекол, а также точность микроконтактных печатных паттернов.

Это необходимо для обеспечения правильной сборки нановолокон и наноструктур ВКМ. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте преполимер полидиметилсилоксана (PDMS), смешав основу эластомера и отвердитель в массовом соотношении 10:1; обычно используются 80 г основы и 8 г отвердителя, чтобы гарантировать наличие достаточного количества PDMS для покрытия мастер-формы слоем толщиной 1 см. Смешайте и дегазируйте PDMS с помощью центробежного миксера, установив следующие параметры: смешивание при 2000 RPM в течение двух минут, дегазация при 2000 RPM в течение двух минут. Осторожно вылейте.

Нанесите преполимер PDMS на мастер-форму, чтобы создать слой толщиной один сантиметр, затем запекайте PDMS при 65 °C в течение четырех часов. После отверждения с помощью скальпеля вырежьте область с рисунком, чтобы сформировать штамп из PDMS. Это позволит отличить рабочую сторону штампа из PDMS от его обратной стороны.

Вырежьте выемку в одном из углов на задней стороне штампа. Начните процедуру с очистки предметных стекол диаметром 25 мм: поместите стекла в ультразвуковую ванну с 95% ethanol на один час, затем высушите их в печи при 65 °C. Далее приготовьте раствор поли- и изопропилакриламида (PIAM), растворив PIAM в 1-бутаноле до концентрации 10%. Установите чистое предметное стекло по центру вакуумного зажима центрифуги-покрывателя и пипеткой нанесите 200 µL раствора PIAM на стеклянную поверхность так, чтобы она была полностью покрыта.

Нанесите покрытие на покровное стекло методом центрифугирования при 6 000 RPM в течение одной минуты. Очистите штампы из PDMS путем соникации в 50% ethanol в течение 30 минут, после чего высушите их потоком азота; все последующие этапы следует проводить в боксе биологической безопасности для поддержания стерильности в тех случаях, когда наноструктуры внеклеточного матрикса или ECM будут использоваться с клетками. Этап микроконтактной печати является самым сложным аспектом данной процедуры.

Перед использованием важно осмотреть штампы из PDMS на наличие видимых дефектов. Также не следует использовать растворы белков, приготовленные более двух недель назад. Поместите покровные стекла, покрытые PIAM, в закрытую чашку Петри и стерилизуйте их с помощью УФ-облучения.

Достаточно 45 минут воздействия УФ-излучения в боксе биологической безопасности. Нанесите 200 µL раствора белка на рабочую поверхность каждого штампа из PDMS. В данном случае используется фибронектин (FN) в концентрации 50 µg/mL в стерильной дистиллированной воде.

Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, после чего промойте штампы из PDMS дистиллированной водой для удаления избытка белка и тщательно высушите потоком азота. Важно полностью удалить воду, чтобы избежать преждевременного растворения трубки. Покрытие PAM на покровном стекле и неправильный перенос белка.

Выполните микроконтактную печать, приложив сторону со структурой штампа из PDMS к покровному стеклу, покрытому трубчатым PAM, если это необходимо. С помощью пинцета аккуратно постучите по задней стороне штампа, чтобы удалить пузырьки воздуха и обеспечить равномерный контакт; выдержите в таком состоянии пять минут. Отделите штамп из PDMS от покровного стекла.

На данном этапе, в зависимости от целей исследования, можно нанести дополнительные белки внеклеточного матрикса (ВКМ) для создания более сложных многокомпонентных структур. После завершения печати паттерна ВКМ поместите покровное стекло с нанесенным паттерном и покрытием из PAM в чашку Петри диаметром 35 мм и с помощью фазово-контрастной микроскопии проверьте точность воспроизведения паттерна.

В зависимости от типа паттерна для разрешения его особенностей может потребоваться ПЗС-камера. Также может быть использована флуоресцентная микроскопия для проверки паттерна, при условии, что белки внеклеточного матрикса (ECM) помечены флуоресцентно. После подтверждения точности воспроизведения паттерна добавьте в чашку Петри три миллилитра дистиллированной воды с температурой 40 °C и дайте воде постепенно охладить раствор в трубке.

Слой PAM и высвобождение паттернов белков ВКМ можно контролировать с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обычно для того, чтобы убедиться в высвобождении наноструктур белков ВКМ, воду охлаждают до комнатной температуры, которая значительно ниже нижней критической температуры растворения pipe, pam, составляющей 32 °C. Если условия применения не позволяют использовать оптические методы, процесс высвобождения можно контролировать путем измерения температуры раствора.

После высвобождения слоя ПАМ из трубки нановолокна и другие наноструктуры будут плавать в воде. Для дальнейшего использования нановолокна и другие наноструктуры необходимо подвергнуть манипуляциям, однако конкретный подход будет зависеть от целей эксперимента. Здесь представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие, что поверхностно-инициированная сборка (SIA) позволяет конструировать нановолокна белков внеклеточного матрикса с точным контролем размеров волокон.

Массив прямоугольников из фибронектина длиной 50 micrometers и шириной 20 micrometers был нанесен на покровное стекло, покрытое piam; затем была добавлена деионизированная вода при температуре 40 °C с последующим охлаждением ниже нижней критической температуры раствора piam, что вызвало растворение piam и высвобождение нановолокон фиброина. После высвобождения волокна сократились, так как находились под воздействием собственного предварительного напряжения.

Анализ размеров нановолокон фибронектина, нанесенных на поверхность piam до их высвобождения, показал, что они были монодисперсными со средней длиной 50.19 ± 0.49 µm и средней шириной 19.98 ± 0.17 µm. После высвобождения нановолокна заметно сократились, но остались монодисперсными со средней длиной 14.15 ± 0.92 µm и средней шириной 2.65 ± 0.32 µm. Атомно-силовая микроскопия позволила более детально рассмотреть изменения размеров волокон, связанные с процессом высвобождения SIA.

Примечательно, что волокна до высвобождения имели равномерную толщину около пяти нанометров, тогда как толщина волокон после высвобождения составляла порядка нескольких сотен нанометров, при этом их длина и ширина уменьшились. С помощью процесса SIA можно создавать разнообразные наноструктуры белков внеклеточного матрикса с регулируемым размером, формой и составом. Например, на трубке были сформированы нановолокна фибронектина, первоначально имевшие ширину 20 микрометров и длину один сантиметр.

Покрытое PAM покровное стекло после охлаждения и промывки. При растворении PAM нановолокна высвобождались, образуя длинные нити с уменьшенной шириной около трех микрометров. Кроме того, поскольку паттерн определяется топографией поверхности штампа из PDMS, используемого для микроконтактной печати, можно создавать сложные наноструктуры из белков ВКМ в качестве доказательства концепции.

Были созданы многолучевые фиброиновые звезды. Термическое воздействие привело к сокращению лучей, но не центральной области звезды, в которой лучи соединялись между собой. SIA также работает с другими белками ВКМ, такими как ламинин или LN, при этом в одну и ту же структуру могут быть включены несколько белков ВКМ.

В данном примере были созданы паттерны из ортогонально пересекающихся линий фибронектина шириной 20 мкм (показаны красным) и линий ламинина шириной 50 мкм (показаны зеленым), интегрированных в 2D-наноткань; после их высвобождения оба типа нановолокон сократились, однако общая взаимосвязанность и структура квадратной решетки сохранились. Эти результаты демонстрируют, что SIA может быть использован для создания материалов внеклеточного матрикса с различными составами и структурами. В завершение представлены некоторые примеры неудачного применения SIA для нановолокон ВКМ.

Одной из причин является неправильное высвобождение незавершенного паттерна из-за плохого переноса белков ЭКМ на поверхность piam. При микроконтактной печати наличие отверстий, неровных краев и других дефектов приводит к образованию нановолокон и наноструктур, которые остаются незавершенными и склонны к разрыву и фрагментации при высвобождении. Быстрое растворение pipe PAM также может привести к низкой точности воспроизведения паттерна после высвобождения.

Например, при использовании воды с температурой 20 °C, которая уже ниже нижней критической температуры растворения, piam будет быстро набухать и растворяться. Это может привести к резкому сокращению и разрыву нановолокон, как показано на 32-м изображении, и формированию случайных неупорядоченных конфигураций, как показано на изображении на 52-й секунде.

Перед началом данной процедуры проверьте состояние штоков из PDMS на наличие дефектов, а также убедитесь, что все поверхности очищены от пыли. В противном случае это препятствует надлежащему переносу белка и приводит к неправильной сборке структур A CM. После выполнения данной процедуры полученные нановолокна или наноструктуры могут быть использованы для различных целей, например, для анализа механических свойств белковых волокон или в качестве скаффолдов для тканевой инженерии.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать принципы создания нановолокон и наноструктур из белков внеклеточного матрикса (ВКМ) с регулируемым составом, геометрией и архитектурой. В частности, вы узнаете, как с помощью микроконтактной печати наносить паттерны белков ВКМ на покрытые питоном стеклянные покровные стекла, а затем инициировать термическое растворение поверхности для сборки структур ВКМ.