Мониторинг Ассамблею секретируемым бактериального вирулентности фактор Использование сайт-специфической сшивания

Общая цель данного эксперимента — изучить динамику белковых взаимодействий внутри живой клетки. Это достигается путем первичной экспрессии представляющего интерес белка в кишечной палочке, включения аналога аминокислоты бензоилфенилаланина в белок в определенном месте и выполнения радиомечения с погоней за пульсом для мечения небольшой популяции синхронно синтезированных белковых молекул. В качестве второго шага.

Аликвоты клеток, собранных в различные моменты времени во время погони, облучаются, чтобы вызвать образование ковалентных связей между интересующим белком и любыми факторами, с которыми он взаимодействует. Следующие белки иммуноципитированы специфическими антителами и разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS С целью идентификации взаимодействующих факторов получены результаты, которые показывают изменения во взаимодействиях между интересующим белком и другими внутриклеточными факторами с течением времени на основе изменений электрофоретической подвижности продуктов сшивки. Основным преимуществом этого метода перед существующими методами, такими как соиммунопреципитация или химическое сшивывание, является его способность генерировать временную информацию о взаимодействиях, которые происходят между конкретным остатком в интересующем белке и другими молекулами.

Такие данные особенно ценны при изучении прогрессии белка по многоступенчатому пути сборки и для идентификации промежуточных продуктов сборки. Хотя этот метод был оптимизирован для использования в кишечной палочке, он также может быть использован в других системах, включая другие бактерии, дрожжи и клетки млекопитающих. Подробности по подготовке культуры можно найти в текстовом протоколе.

Кратковременно приготовьте пять миллилитров М-9 среды, содержащей 0,2% глицерина, все аминокислоты, кроме метионина и цистина, и антибиотики начните культивирование в течение ночи с добавления кишечной палочки, трансформированной плазмидой, которая кодирует интересующий белок с мутацией янтаря, и плазмидой, кодирующей систему подавления янтаря, инкубируют при 37 градусах Цельсия. В день эксперимента добавьте соответствующее количество клеток из ночной культуры в колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров, содержащую 50 миллилитров среды М-9 и антибиотики, чтобы получить оптическую плотность на уровне 550 нанометров 0,03. Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане.

Когда культуры достигнут ранней или средней фазы логарифма, добавьте 50 микролитров одного моляра бензоилфенилаланина или BPA в каждую культуру. Добавляйте бисфенол А по одной капле за раз, поворачивая колбу, чтобы избежать осадков. Затем добавьте все индукторы, которые необходимы для стимуляции экспрессии янтарного мутанта.

Продолжайте инкубировать культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение еще 30 минут в течение 30-минутного периода индукции. Промаркируйте шесть одноразовых 15-миллилитровых центрифужных пробирок с указанием времени и либо плюс УФ, либо минус УФ. Положите пробирки с маркировкой на лед.

Поместите планшет для культуры тканей на шесть лунок поверх второго ведра со льдом, наполненного льдом. Включите УФ-лампу за пять минут до нанесения радиомаркировки. Затем добавьте примерно два миллилитра льда в каждую пробирку с маркировкой «минус ультрафиолет» и в две лунки в многолуночной пластине.

Очень важно проветривать лед непосредственно в трубки и лунки, чтобы немедленно остановить внутриклеточные реакции в каждой временной точке и тем самым получить точный снимок биохимического пути в конце 30-минутного периода индукции. Переложите 25 миллилитров культуры в предварительно подогретую 125 миллилитровую одноразовую колбу Эрленмейера. Поместите колбу на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия.

Этапы импульсной маркировки и УФ-облучения должны быть выполнены своевременно и требуют значительной организации и предварительной подготовки. Добавьте в культуру 30 микрокюри на миллилитр метионина и цистеина S 35, меченных метионином и цистеином, и быстро перемешайте. Одна минута ноль секунд.

Добавьте 250 микролитров нерадиоактивного 100 миллимолярного раствора метионина цистеина и быстро перемешайте. Чтобы немедленно перемешать, пипеткой внесите четыре миллилитра культуры в одну из лунок охлажденного многолуночного планшета, содержащего ледяную пипетку, вторую четыре миллилитра аликвоту в 15-миллилитровую пробирку с маркировкой «ноль минут минус ультрафиолет». Две минуты ноль секунд.

Пипеткой введите четыре миллилитра культуры во вторую лунку охлажденной многолуночной пластины, содержащей лед. Затем пипеткой введите еще четыре миллилитровых аликвоты в 15-миллилитровую пробирку с маркировкой «одна минута минус ультрафиолет» непосредственно перед пятиминутной временной точкой примерно в два миллилитра льда в третью лунку в многолуночной пластине в момент шести минут без секунд. Пипеткой внесите четыре миллилитра культуры в третью лунку охлаждаемой многолуночной пластины, содержащей ледяную трубку.

Набрал еще четыре миллилитра аликвоты в 15 миллилитровую трубку с маркировкой пять минут минус ультрафиолетовое излучение. Поместите ведро со льдом с многолуночным планшетом под предварительно нагретую ультрафиолетовую лампу и облучайте каждый образец по отдельности в течение четырех минут. Переложите клетки в охлажденные 15-миллилитровые пробирки с маркировкой «ноль минут плюс ультрафиолет», «одна минута плюс ультрафиолет» и так далее.

Затем центрифугируйте ячейки при температуре 2,500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте каждый образец в 300 микролитрах М, девяти средах или PBS и 33 микролитрах 100% холодной трихлоруксусной кислоты или ТСА для осаждения белков. Перед удалением сата добавьте в каждый образец по 50 микролитров солюбилизационного буфера и нагревайте с перемешиванием до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут для растворения осажденного белка.

После добавления одного миллилитра радиоиммунопреципитационного буфера проводят стандартные иммунопреципитации с использованием от одной пятой до половины каждого образца. Разрешите иммунопреципитированные белки с помощью сульфата натрия ESAL, электрофореза в полиакриламидном геле или SDS page. Наконец, подвергнуть окрашенные и высушенные гели воздействию фосфосного экрана на ночь и обнаружить радиоактивные белки, включая продукты сшивки, с помощью фосфо-имиджера-сайт-специфичного фотосшивки использовали для идентификации белков, которые взаимодействуют с ESPP во время его путешествия к внешней мембране.

Для этого эксперимента кодоны рН аланина на остатках 1113 и 1214 бета-домена ESPP были заменены на янтарные кодоны. Кристаллическая структура бета-домена ESPP показывает, что оба остатка находятся на периплазменной стороне бета-бочки, разделенные примерно на 120 градусов. Два различных полипептида были иммунопреципитированы как из облученных, так и из контрольных клеток с помощью С-концевого анти-ESPP и сыворотки.

Первоначально в более поздние моменты времени преобладала форма белка-предшественника размером около 135 килодальтон, содержащая ковалентно связанные пассажирские и бета-домены. Уровень PRO ESPP снижался, и свободный бета-домен стал преобладать, так как пассажирский домен был транс расположен поперек внешней мембраны и отделен от бета-домена протеолитическим расщеплением. Однако образцы, излучаемые УФ-излучением I, явно имели более высокие полосы молекулярной массы, которых не было в контрольных образцах.

Эти полосы образуются в результате сшивки PRO ESPP с взаимодействующими белками на основе подвижности этих полипептидов, размеры взаимодействующих белков были оценены, чтобы проверить, могут ли они соответствовать известным факторам сборки белков внешней мембраны. Проводили дополнительные иммуноципитации с использованием антицера, генерируемых против предполагаемых взаимодействующих партнеров. Полипептид с концентрацией 150 килодальтон, который наблюдался при включении BPA в оба остатка 1113 и 1214, может быть иммуноосаментирован антисывороткой против 17-килодальтонного периплазматического шаперона.

Кроме того, мы обнаружили, что более крупные полипептиды, которые наблюдались при включении BPA только в одну из двух позиций, могут быть иммунопреципитированы с антицеральными субъединицами против субъединиц комплекса BAM, BAM B и BAM D соответственно. После выполнения этой процедуры продукты сшивания могут быть очищены и могут быть выполнены другие методы, включая масс-спектрометрию, чтобы помочь идентифицировать факторы, которые взаимодействуют с интересующим белком. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как успешно сочетать мечение пульса с сайт-специфичным фотокросслинкингом для изучения динамики взаимодействия вашего белка, представляющего интерес, с другими молекулами внутри живой клетки.