Анализ Yersinia энтероколитные Эффектор Транслокация в клетки-хозяева с помощью Бета-лактамазы эффекторных Слияния

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы измерить транслокацию эффекторного белка в клетки-хозяева через систему секреции третьего типа. Это достигается путем инкубации клеток пятки с мутантами иерсинии, экспрессирующими эффекторные слияния бета-лактамаз TEM one, чтобы обеспечить транслокацию эффекторных слияний в клетки HELOC. В качестве второго шага инфицированные клетки HELOC загружаются клеточным репортерным соединением, которое обрабатывается клеточным эстро до заряженного флуоресцентного CCF 4 и, таким образом, захватывается внутри клетки.

Последующее расщепление CCF 4 транс-локализованной бета-лактамазой приводит к нарушению fre, которое регистрируется с помощью лазерной сканирующей микроскопии с целью анализа интенсивности донорной и акцепторной флуоресценции. Результаты показывают различное количество транс-локализованных эффекторов TEM one бета-лактамаз на основе различной кинетики повышения донорской флуоресценции. Одним из основных преимуществ этого метода по сравнению с существующими методами является то, что межклеточный процессинг соединения CCF four обеспечивает высокоспецифичный и чувствительный инструмент для измерения транслокации.

Метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериального патогенеза, например, как точно настраивается транслокация во время взаимодействия бактерий и клеток хозяина за сутки до заражения. Инокулируйте три отдельных флакона, содержащих три миллилитра среды LB и необходимые антибиотики, с одной колонией от каждого из трансформированных штаммов Y. enterocolitica, приготовленных в соответствии с описанием в сопроводительном текстовом протоколе. Кроме того, за день до заражения подготовьте планшеты, содержащие пяточные клетки, путем посева 15 000 клеток в 200 микролитров питательной среды в девять лунок 96-луночного планшета, инкубируйте клетки в инкубаторе с 5% содержанием CO2 при температуре 37 градусов Цельсия в день заражения.

Введите два миллилитра ночной культуры в 40 миллилитров свежей среды без антибиотиков. Инкубируйте бактерии в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере со скоростью 180 оборотов в минуту. Это вызовет экспрессию системы секреции третьего типа через 90 минут, перенесет культуры в свежую пробирку и сохранит культуры на льду.

С этого момента и далее. Центрифугируйте культуры в течение 10 минут при температуре 5 000 G и четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать бактерии. Далее повторно суспендируйте гранулу в двух-трех миллилитрах ледяного PBS, разведите бактериальную суспензию до концентрации 800 миллионов колониеобразующих единиц на миллилитр, а затем поместите культуры на лед.

Затем определите соответствующую оптическую плотность каждой культуры. Добавьте по 3,5 микролитра бактериальной суспензии от каждого штамма в разные лунки из подготовленных 96. Хорошо наложите на поверхность и перемешайте, осторожно пипетируя среду дважды, дайте бактериям оседать на клетках в массе инфекции около 100 бактерий на клетку.

Проведите временной курс, запуская инфекции с 30-минутными интервалами и поддерживая клетки в камере с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия. После каждой инфекции, через 90 минут после первой инфекции, осторожно отсасывайте среду, не удаляя ни одной из клеток хелы. Затем добавьте 50 микролитров PBS, содержащих 20 микрограмм на миллилитр левомицетина, и 2,5 миллимоляра пронока.

Это остановит экспрессию эффекторов и уменьшит экспорт CCF 4. Для приготовления микроскопии необходимо обеспечить непрерывное погружение, распределив иммерсионную среду на дно лунок, с помощью одномиллилитрового шприца. Избегайте улавливания пузырьков воздуха в погружной среде.

Затем перенесите 96-луночный планшет на предметный столик микроскопа и найдите подходящие места для последующего анализа в каждом из них. Что ж, завершите этот шаг в течение 10 минут. Затем добавьте в каждую по 70 микролитров загрузочного раствора CF 4:00 AM.

Хорошо инкубируйте тарелку в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее отсасывайте нагрузочный раствор и добавляйте 100 микролитров PBS, содержащих 20 микрограмм на миллилитр левомицетина и 2,5 миллимоларов проника. Затем быстро приступают к микроскопии.

Установите на место иммерсионный объектив с 20-кратным увеличением и высокой числовой апертурой, откройте отверстие детектора на 2,5 единицы воздуха и перенесите 96-луночную пластину в столик для конфокального лазерного сканирования. Далее выберите высокочувствительные детекторы арсенид-фосфата галлия с одновременно активными донорным и акцепторным каналами. Восьмиразрядная глубина, трехкратное усреднение кадров и возбуждение с помощью 10% 405 нанометрового диодного лазера.

Чтобы обеспечить правильную количественную оценку, установите коэффициент усиления детектора обоих каналов на одно и то же значение и избегайте насыщенных пикселей. Затем активируйте проходящий свет и повторно проверьте репрезентативные поля зрения в каждом, отрегулируйте и при необходимости сохраните положения с помощью откалиброванного автоматического каскада. Наконец, установите интервальную съемку на две минуты, продолжительность на два часа и начните получение изображений.

После получения изображения импортируйте набор данных в программное обеспечение, позволяющее выполнять арифметические вычисления матриц пикселей. Вычтите фон в обоих каналах с использованием одного и того же смещения, сначала кликнув по меню, а затем перейдите к обработке изображения и выберите базовое вычитание. Затем выберите каждый канал и введите базовое значение.

Исправьте прокачку через канал-донор, передайте первый канал в канал акцептора два с заранее заданным поправочным коэффициентом, создав для этой цели новый канал номер два. Нажмите на меню, а затем выберите «Обработка изображения», затем «Арифметика канала» и введите абсолютное значение второго канала, вычтенное на пункт 33 раза. После этого создайте первый канал, удалите второй канал и убедитесь, что обрез через исправленный канал Accepter остается новым вторым каналом.

Затем создайте новый канал с помощью показанной здесь операции для определения относительного коэффициента лада. Затем вернитесь в меню арифметики каналов и введите второй канал, разделенный на первый канал плюс второй канал для правильной визуализации канала лада. В восьмибитном изображении создайте четвертый канал четыре, который равен 255 умножить на третий канал.

Измените цвет канала, перейдя в меню свойств изображения, выберите четвертый канал, затем сопоставленный цвет, затем файл таблицы цветов и выберите струю. Затем примените медианный фильтр три на три к третьему и четвертому каналам. Это позволит уменьшить шум на изображениях, войдя в меню обработки изображений и выбрав сглаживание.

Затем выберите фильтр медианы, выберите оба канала и примените фильтр размером три на три на один для количественной оценки сигналов сотовой связи. Определите ячейки в четвертом канале, выбрав вид за пределами и щелкнув по значку. Добавьте новые поверхности.

Определите параметры алгоритма обнаружения в окне поверхности и установите два флажка. Сегментируйте только интересующую область и обработайте все изображение. Наконец, далее определите интересующую область, отредактировав ее размеры.

Выберите четвертый канал в качестве исходного канала и установите пороговое значение, перейдя в меню пороговых значений и выбрав «Фоновое вычитание». Установите диаметр равным 10 микрометрам, минимальный порог интенсивности вручную равным нулю, а максимальный порог — максимальной интенсивности. Отфильтруйте конструкции по площади и установите минимальное значение 187 квадратных микрометров.

Затем завершите обнаружение поверхности. Наконец, извлеките средние значения интенсивности донорной флуоресценции в первом канале и относительный коэффициент лада в третьем канале, а также их стандартные отклонения в клеточном организме. Чтобы продемонстрировать способность этого метода количественно анализировать транслокацию эффекторов в клетки-мишени, были изучены два штамма иерсиний с различной кинетикой транслокации с использованием как донорской флуоресценции, так и относительных коэффициентов ладов.

Инфицированные клетки дикого типа демонстрируют увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени. Как и ожидалось, максимальный наклон интенсивности флуоресценции положительно коррелирует с продолжительностью инфекции, что указывает на то, что в соответствии с предыдущими исследованиями можно различать различные концентрации транслируемой бета-лактамазы. Клетки, инфицированные мутантом делеции YOPE yersinia, демонстрируют более быстрое увеличение интенсивности флуоресценции по сравнению со штаммом дикого типа.

Интересно, что расширение инфекции до 90 минут не ускорило рост донорской флуоресценции по сравнению с 60 минутами инфекции При попытке проведения этой процедуры важно иметь в виду, что обработка соединения CCR four начинается сразу после его добавления. Поэтому важно вовремя начать получение изображения.