Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

Общей целью данного эксперимента является изучение интерференции факторов вирулентности бактерий с внутриклеточной сигнализацией. Это достигается за счет создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих интересующий белок Для изучения его активности на уровне объемной клетки в качестве второго шага создается индуцируемая система экспрессионных векторов, которая позволяет активировать сигнальный каскад клетки-хозяина на определенном этапе. Далее будет проведен анализ того, может ли интересующий белок вмешиваться в активацию сигнального каскада клетки-хозяина, чтобы сузить точку активности интересующего белка, результаты показывают, что уютный желтый фактор вирулентности Бернетта KA B вмешивается в апоптотический каскад ниже по течению назад и выше по каскаду активации 3 на основе вестерн-блоттинг-анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инфекционной биологии, такие как определение ключевого этапа каскада передачи сигнала, на котором данный бактериальный эффекторный белок вмешивается. Это поможет нам не только лучше понять, как патогенные микроорганизмы манипулируют своими хозяевами, но и как функционируют эти основные клеточные процессы. Хотя этот метод может дать представление о бактериальных стратегиях предотвращения апоптотической гибели клеток, он также может быть применен к другим системам передачи сигналов в области клеточной смерти, таким как ОНС или пироптоз, а также к сигнальным сетям, которые участвуют в пролиферации клеток, регуляции генов или реакциях иммунной системы.

Демонстрировать эту процедуру будет Стефани Беслер, аспирантка из лаборатории Манна. Начните эту процедуру с посева HEK 2 93 клеток, стабильно экспрессирующих GFP или GFP, скажем, B в a 12. Луночный планшет с плотностью 100 000 ячеек на лунку.

Далее приготовьте ДНК и полиэтиленовый средний реагент для трансфекции отдельно в 75 микролитрах опт-среды, и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре для образования комплекса. Инкубируйте обе смеси вместе в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого добавьте раствор полиэтиленовой ДНК по каплям в клетки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Через пять часов после трансфекции индуцируйте экспрессию проапоптотических белков путем добавления одного микрограмма на миллилитр доксициклина в культуральную среду. Затем инкубируйте клетки в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе под световым микроскопом. Осмотрите клетки на предмет индукции клеточной смерти перед забором.

Исследуйте индуцированные апоптотические клетки, которые обнаруживаются по присутствию апоптотических телец. Далее удалите надосадочную жидкость и промойте прилипшие клетки. После теплого PBS ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах двух х ламби образца буфера.

Затем нагрейте в течение пяти минут до 95 градусов Цельсия, а для последующего использования храните при температуре минус 20 градусов Цельсия. После этого загрузите шесть микролитров коммерческой белковой лестницы в качестве маркера молекулярной массы. Затем загрузите примерно 40 000 клеток на образец на 12%-ный гель SDS.

Запустите гели в системе гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 вольт в течение 45-60 минут с одним x laly работающим буфером. После этого BLO выводит белки на мембраны PVDF при постоянном напряжении 16 вольт в течение 60 минут. С помощью полусухой передаточной ячейки Trans blot SD затем заблокируйте мембраны в 10 миллилитрах MPT на один час при комнатной температуре.

Разведите семь микролитров антитела против расщепленного PARP в семи миллилитрах МФТ. Инкубируйте мембрану PVDF с раствором антитела в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Удалить раствор антитела и выполнить три 10-минутных промывки PBS 0,05%Tween 20, инкубировать мембраны с 1,4 мкл конъюгированных вторичных антител к пероксидазе хрена, разведенных в семи миллилитрах МФТ в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации.

Трижды промыть мембраны PBS 0,05%Tween 20, определить активность пероксидазы хрена с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. И применить стандартное оборудование для проявки пленки для визуализации белковых полос. Затем удалите связанные антитела путем инкубации мембран с семью миллилитрами буфера для стриппинга вестерн-блоттинг в течение 30 минут при комнатной температуре после трех промывок с PBS 0,05%Tween 20, прозондируйте мембраны четырьмя микролитрами антиактиновых антител в четырех миллилитрах MPT в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

На следующий день выполните три 10-минутных промывки мембран примерно 10 миллилитрами PBS 0,05%Tween 20, затем инкубируйте мембраны с 1,4 микролитрами конъюгированных вторичных антител к пероксидазе хрена, разведенных в семи миллилитрах MPT после одного часа инкубации при комнатной температуре. Трижды промойте мембраны PBS 0,05%Tween 20, определите активность пероксидазы хрена с помощью коммерческого набора и примените стандартное оборудование для проявки пленки для визуализации запретов белков. В этом эксперименте цельноклеточные лизаты HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP sabe клеток были иммуноферментированы, чтобы GFP показал стабильную экспрессию.

Репрезентативный анализ клеток проточной цитометрии HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP sabe показывает интенсивность экспрессии GFP. HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP клетки sabe обрабатывали четырьмя микромолярными споринами в течение шести часов для индуцирования внутреннего апоптоза. Апоптоз анализировали с помощью иммуноблоттинга с расщеплением PARP, в котором было обнаружено снижение расщепления PARP в HK 2 9 3 GFP SA B клеток по сравнению с HK 2 93 GFP клетками.

CB защищает от апоптоза, индуцированного bax, но не от апоптоза, индуцированного каспазой 3. При реализации этой процедуры важно исследовать как можно больше компонентов сигнального пути, чтобы помочь определить этап взаимодействия. Также хорошо тестировать белки, которые активируются как в основном, так и в активированном состояниях, чтобы определить, влияет ли выбранный эффекторный белок на сам путь или, скорее, на этап активации после этой процедуры.

Другие методы, такие как нокдаун, нокаут, дрожжи, два гибридных pull-down, посттрансляционная модификация или анализ протеолитической стабильности, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: каковы точные молекулярные механизмы, которые эти микробные эффекторы используют для манипулирования нормальной физиологией клетки-хозяина? И как это способствует выживанию и распространению патогена.