Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении влияния факторов бактериальной вирулентности на внутриклеточную сигнализацию. Это достигается путем создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих исследуемый белок. Для изучения его активности на уровне всей популяции клеток на втором этапе создается система индуцибельных экспрессионных векторов, которая позволяет активировать сигнальный каскад клетки-хозяина на определенном этапе. Далее анализируется, может ли исследуемый белок препятствовать активации сигнального каскада клетки-хозяина, чтобы сузить область его активности; результаты вестерн-блоттинга показывают, что фактор вирулентности KA B из cozy yellow Burnett вмешивается в апоптотический каскад ниже по течению от backs и выше активации cascade three.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии инфекций, например, определить основной этап в каскаде передачи сигнала, на который воздействует конкретный бактериальный эффекторный белок. Это позволит не только лучше понять, как патогенные микроорганизмы манипулируют своими хозяевами, но и прояснить механизмы функционирования этих базовых клеточных процессов. Хотя этот метод может дать представление о стратегиях бактерий по предотвращению апоптотической гибели клеток, его также можно применить к другим системам передачи сигнала в области клеточной смерти, таким как некроптоз или пироптоз, а также к сигнальным сетям, участвующим в пролиферации клеток, регуляции генов или реакциях иммунной системы.

Эту процедуру продемонстрирует Стефани Беслер, аспирант из лаборатории Манна. Начните процедуру с посева клеток HEK 2 93, стабильно экспрессирующих GFP или GFP, say B, в 12-луночный планшет с плотностью 100 000 клеток на лунку.

Затем отдельно подготовьте ДНК и полиэтиленовый реагент для трансфекции в 75 µL среды Opti-MEM и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре для формирования комплексов. Инкубируйте обе смеси вместе в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого по каплям добавьте раствор ДНК с полиэтиленом к клеткам и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2.

Через пять часов после трансфекции индуцируйте экспрессию проапоптотических белков, добавив в культуральную среду доксициклин в концентрации 1 µg/mL. Затем инкубируйте клетки в течение 18 часов при 37 °C в атмосфере с 5% CO₂. Перед сбором клеток проверьте их под световым микроскопом на наличие признаков индукции гибели клеток.

Осмотрите индуцированные апоптотические клетки, которые определяются по наличию апоптотических телец. Затем удалите супернатант и промойте адгезированные клетки. Один раз промойте клетки теплым PBS и ресуспендируйте их в 100 µL двухкратного буфера Ламби для образцов.

Затем нагревайте в течение пяти минут при 95 °C, после чего храните при -20 °C для последующего использования. Далее нанесите 6 µL коммерческого белкового маркера в качестве маркера молекулярной массы. Затем нанесите примерно 40 000 клеток на образец на 12% SDS-PAGE гель.

Проведите электрофорез в системе для гель-электрофореза при постоянном напряжении 180 вольт в течение 45–60 минут, используя 1x рабочий буфер для электрофореза. Затем перенесите белки на PVDF-мембраны при постоянном напряжении 16 вольт в течение 60 минут, используя камеру для полусухого переноса Trans Blot SD. После этого заблокируйте мембраны в 10 миллилитрах MPT в течение одного часа при комнатной температуре.

Разведите 7 µL антител к расщепленному PARP в 7 мл MPT. Инкубируйте мембрану PVDF с раствором антител в течение ночи при температуре 4 °C. Удалите раствор антител и проведите три промывки по 10 минут в PBS с 0,05% Tween 20, затем инкубируйте мембраны с 1,4 µL вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в 7 мл MPT, в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации.

Промойте мембраны трижды раствором PBS с 0,05% Tween 20, определите активность пероксидазы хрена с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Для визуализации белковых полос используйте стандартное оборудование для проявки пленок. Затем удалите связанные антитела, инкубируя мембраны с 7 мл буфера для стриппинга вестерн-блоттинга в течение 30 минут при комнатной температуре после трехкратной промывки раствором PBS с 0,05% Tween 20; проведите инкубацию мембран с 4 µL антител к actin в 4 мл MPT в течение ночи при 4 °C.

На следующий день проведите три этапа промывки мембран по 10 минут примерно в 10 миллилитрах PBS 0,05% Tween 20, затем инкубируйте мембраны с 1,4 микролитрами вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в семи миллилитрах MPT. После одного часа инкубации при комнатной температуре промойте мембраны трижды в PBS 0,05% Tween 20, определите активность пероксидазы хрена с помощью коммерческого набора и используйте стандартное оборудование для проявки пленки с целью визуализации белковых полос. В данном эксперименте были проведены иммуноблоттинги лизатов целых клеток HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP sabe на GFP для подтверждения стабильной экспрессии.

Представительный анализ методом проточной цитометрии клеток HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP sabe демонстрирует интенсивность экспрессии GFP. Клетки HEK 2 93 GFP и HEK 2 93 GFP sabe обрабатывали спорином в концентрации 4 µM в течение шести часов для индукции внутреннего апоптоза. Апоптоз анализировали с помощью иммуноблоттинга на расщепленный PARP, при этом было обнаружено, что расщепление PARP в клетках HK 2 9 3 GFP SA B снижено по сравнению с клетками HK 2 93 GFP.

CB защищает от апоптоза, индуцированного bax, но не от апоптоза, индуцированного каспазой-3. При выполнении данной процедуры важно исследовать как можно больше компонентов сигнального пути, чтобы помочь определить этап взаимодействия. Также рекомендуется тестировать белки как в их исходном, так и в активированном состояниях, чтобы определить, препятствует ли выбранный эффекторный белок работе самого пути или же этапу активации, следующему за данной процедурой.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как: каковы точные молекулярные механизмы, которые эти микробные эффекторы используют для манипулирования нормальной физиологией клеток хозяина, и каким образом это способствует выживанию и распространению патогена, могут быть применены другие методы, включая нокдаун, нокаут, дрожжевую двухгибридную систему, пул-даун, анализ посттрансляционных модификаций или определение протеолитической стабильности.