Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Общая цель следующего эксперимента заключается в экстракции белков из тканей головного мозга человека и мыши для протеомного анализа. Это достигается путем использования общего лизирующего буфера для обеспечения идентичной экстракции белков, адаптированной для методов двумерного электрофореза. Затем для разделения белков с целью их последующей идентификации методом масс-спектрометрии применяется двумерный флуоресцентный дифференциальный гель-электрофорез.

Затем проводится миниатюрный двухмерный электрофорез в геле с иммуноблоттингом для идентификации посттрансляционных модификаций. Результаты могут продемонстрировать общую экспрессию белков. Изменения в трансляции хозяина, все продукты лигаментизации и каталитические продукты определяются на основе различий в изоэлектрической точке и молекулярной массе.

Сочетание 2D-Dash и 2D-Monolo может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейропротеомики, одновременно предоставляя информацию об изменениях экспрессии, посттрансляционных модификациях и катаболизме белков. Начните со сбора и гомогенизации тканей головного мозга. Для тканей головного мозга человека подготовьте пробу с соотношением массы ткани к объему экстракционного буфера 10%.

Гомогенизируйте ткань с помощью стеккогомогенизатора, однако для тканей грызунов используйте тефлоновый гомогенизатор, чтобы дезинтегрировать любой из гомогенатов. Проведите соникацию на частоте 60 hertz, используя 30 импульсов по 0,5 секунды. Затем определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, используя BSA в качестве стандарта.

Теперь подготовьте растворы для осаждения хлороформом и метанолом в ведре со льдом. Рассчитайте объем так, чтобы собрать около 125 micrograms для 11 сантиметровых IPG-полосок или около 1.25 milligrams для 18 сантиметровых IPG-полосок. После охлаждения растворов до 4 °C проводите процедуру осаждения строго на льду.

Сначала добавьте три объема метанола, затем один объем хлороформа. Встряхните смесь. Далее добавьте три объема холодной воды.

Перемешайте смесь на вортексе в течение одной минуты, затем центрифугируйте пробирку с образцом при 12 000 Gs в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius. Аспирируйте и удалите супернатант. Затем добавьте три объема метанола, перемешайте на вортексе и осадите белки аналогичным способом.

Высушите собранный осадок белка в потоке азота перед проведением 2D DIGE. Ресуспендируйте белок в буфере для 2D-электрофореза до концентрации 2,5 mg/mL. Затем обработайте образцы ультразвуком, как описано ранее, до момента их использования.

Храните их при температуре -80 °C перед началом данного этапа и после осаждения белка. Необходимо повторно определить концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда, следуя той же процедуре, которая была описана ранее перед мечением красителем psy.

Для проверки качества образца белка проводится электрофорез в ПААГ с SDS. Разведите 15 µg белка в LDS-буфере и нагрейте до 37 °C на водяной бане или в термоблоке. Затем проведите электрофорез на полиакриламидном геле и окрасьте гель раствором кумасси синего в течение не менее одного часа.

Затем выдержите гель в течение ночи в растворе 7% уксусной кислоты и 10% этанола. После подтверждения качества образца белка на следующий день приступают к процедуре мечения SD. Сначала измерьте pH лизата, который должен быть нейтральным или слабощелочным.

Оптимальное значение pH для последующих реакций составляет 8,6. Далее подготовьте реакции конъюгации с красителем для каждого образца белка. Смешайте 50 мкг белка с 400 пмоль красителя S3 и 50 мкг белка с 400 пмоль красителя S5.

Выполните данную процедуру в четырех повторах, чтобы в сумме получить восемь реакций сопряжения D для каждого образца. Для каждого исследуемого образца создайте соответствующий набор реакций сопряжения DI, используя белок из контрольного образца, например, из мозга больного. Затем для каждой пары реакций подготовьте реакцию внутреннего контроля с 400 picomoles CY two и равным представлением всех белков общей массой 250 micrograms.

Маркировка SAI осуществляется путем инкубации всех реакционных смесей при четырех градусах Цельсия в темноте в течение одного часа. После инкубации объедините все наборы из трех различных циановых реакций в объемы по 150 microliter, добавив к каждому набору реакций 200 microliter буфера для 2D-электрофореза. Затем приступайте к этапам 2D-электрофореза.

Начните с подготовки немаркированных белковых растворов для препаративного геля, из которого будут вырезаться белковые пятна для каждого образца и для положительного контроля. Отмерьте 300–350 мкг немаркированного белка в 2D-буфер и дайте им регидратироваться в контакте с полоской IPG. Затем загрузите полоски IPG, перенеся маркированный и немаркированный белки на регидратацию.

Затем закройте каждую лунку полоской IPG. После этого нанесите слой минерального масла и оставьте полоски для пассивной регидратации в растворе белка на ночь при температуре не выше 25 °C. На следующий день проведите изоэлектрическое фокусирование IPG-полосок.

Затем удалите масло и храните полоски IPG при температуре -20 °C для их последующего уравновешивания. Погрузите их в буфер для уравновешивания на 15 минут. После этого перенесите полоски в 4,7% IDO ацетамид в буфере для уравновешивания без добавления DTT, оставив полоски в растворе.

Используйте большую систему для 2D-электрофореза, чтобы залить по четыре 12% SDS-PAGE геля на образец в стеклянных пластинах с низкой флуоресценцией для меченых белков. Также залейте по одному 12% SDS-PAGE гелю в стандартных стеклянных пластинах толщиной 1,5 мм для каждого из немеченых белков. Эти гели являются препаративными.

После охлаждения гелей перенесите полоски на поверхность гелей и накройте их 0,5% Aros. После охлаждения подвергните гели электрофорезу при мощности 2,5 Вт при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи, а затем проведите анализ на следующий день. Многие реакции 2D-электрофореза можно проводить с использованием белковых образцов, применявшихся для препаративных гелей. Отмерьте менее 100 µg образца в 200 µL буфера для 2D-электрофореза.

Затем подвергните смеси образцов интенсивному перемешиванию на вортексе и кратковременно центрифугируйте их. Нанесите образцы на IPG-полоски длиной 11 см и оставьте их для пассивной регидратации на ночь под слоем минерального масла. На следующий день проведите изоэлектрическое фокусирование.

Затем переместите полоски через три ванны с уравновешивающим буфером по 15 минут в каждой. После этого полоски наносят на гели для 2D электрофореза в ПААГ с SDS. Наложите каждую полоску на готовый гель с соответствующим молекулярным весом.

Полиакриламидный гель для целевого белка. Затем перенесите белки с гелей на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану и проанализируйте их с помощью антител в соответствии с данным протоколом. Три различных варианта лизиса.

Было проведено тестирование буферов. Сначала был протестирован общепринятый в биохимии и молекулярной биологии буфер — Tris SDS.

Буфер Tris SDS показал более низкое разрешение по сравнению с другим протестированным буфером UTS. Третий буфер был исключен, так как с его помощью не удалось подготовить тестируемые образцы. Далее были исследованы протеомы головного мозга человека и мыши.

Было проведено сравнение образцов коры головного мозга человека из контрольной группы и образцов коры при болезни Альцгеймера. Также были изучены белки мозга мышей с тау-патологией, характерной для болезни Альцгеймера, совместно с человеческими образцами. Образцы SCI two, S SI three и sci five для каждого D рассматривались независимо. Высокое разрешение пятен облегчило процесс выравнивания.

Качественный мини-2D-анализ использовался для исследования посттрансляционных модификаций; было установлено, что профиль лигандированного альфа-синуклеина в жировой ткани является нормальным, однако он также был обнаружен в форме димера, отмеченного звездочкой. Стрелками указаны места обнаружения альфа-синуклеина. С помощью мини-2D-анализа также был изучен убиквитинированный белок-предшественник амилоида.

Спорадическая форма болезни Альцгеймера сравнивалась с семейной формой. При семейной форме болезни Альцгеймера концентрации бета-амилоида 1–42 и изоварианта ниже, так как были обнаружены лигандные формы массой 8 кДа. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать протеом для сравнения сложных образцов путем измерения модификаций экспрессии белков.