Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг
April 10th, 2014
Протокол добыча общего белка с использованием мочевины / тиомочевины / SDS буфера для человека и мышей мозговой ткани позволяет Идентификация белков по 2D-Dige и их последующей характеристики по мини 2DE иммуноблоттинга. Этот метод позволяет получить более воспроизводимые и надежные результаты от человека биопсии и экспериментальных моделей.
Общая цель данного эксперимента заключается в извлечении белка из тканей мозга человека и мыши для протеомного анализа. Это достигается за счет использования общего буфера для лизиса для получения той же экстракции белка, которая адаптирована для подходов с двумерным электрофорезом. Следующий двумерный флуоресцентный разностный гель-электрофорез используется для разделения белков для масс-спектрометрической идентификации.
Затем следует миниатюрный 2D-гель-электрофорез с иммуноблоттингом для выявления посттрансляционных изменений. Результаты могут показать глобальную экспрессию белка. Хозяин трансляционно изменяет все продукты связки и каталитические процессы на основе разницы в изоэлектрической точке и молекулярной массе.
Комбинация 2D тире и 2D моноло может помочь нам ответить на ключевой вопрос в области нейропротеомики, одновременно предоставляя информацию об изменениях в выражении. Почтовая модификация и катаболизм в продуктах Начинаются с забора и гомогенизации мозговой ткани. Подготовьте ткань при соотношении 10% веса к объему в буфере для экстракции ткани мозга человека.
Гомогенизируйте ткань с помощью стеклянного пипеттера, однако используйте тефлоновый гомогенизатор для разрушения тканей грызунов. Обрабатывайте его ультразвуком на частоте 60 герц с помощью 30 полусекундных импульсов. Затем определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, используя BSA в качестве стандарта.
Теперь соберите растворы для осаждения хлороформа метанола в ведро со льдом. Планируйте собрать около 125 микрограммов для 11-сантиметровых полосок IPG или около 1,25 миллиграмм для 18-сантиметровых полосок IPG. Как только растворы достигнут четырех градусов по Цельсию, выполните выпадение осадков полностью на льду.
Сначала добавьте три объема метанола, затем один объем хлороформа. Встряхните эту смесь. Далее добавьте три объема холодной воды.
Вихревой, эта смесь в течение одной минуты центрифугирует пробирку с образцом при 12 000 Gs в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте три объема метанольного вихря и таким же образом раскрутите белки.
Высушите собранную белковую гранулу под газообразным азотом перед 2D DIGE. Повторно суспендируйте белок в 2D-буфере в концентрации 2,5 мг на миллилитр. Затем обрабатывайте образцы ультразвуком, как это делалось ранее, пока они не будут использованы.
Храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия до начала этого этапа и после выпадения белка. Необходимо еще раз определить концентрацию белка методом Брэдфорда. Следуя той же процедуре, что и перед маркировкой пси-красителя.
Для этой цели качество образца белка проверяется страницей SDS. Разведите 15 микрограммов белка в СПД и нагрейте его до 37 градусов Цельсия в теплой бане или блоке. Затем запустите их на полиакриламидный гель, испачкайте гель раствором синего кумаси не менее чем на час.
Затем задержите гель на ночь в 7% уксусной кислоте, 10% растворе этанола. После того, как качество образца белка установлено, на следующий день начинается процедура маркировки SD. Сначала измерьте pH лизата, который должен быть от основного до нейтрального.
Оптимальный pH для последующих реакций составляет 8,6. Затем настройте реакции конъюгации красителя для каждого образца белка. Смешайте 50 микрограммов с 400 пикомолами красителя S3 и 50 микрограммов с 400 пикомолами красителя S-5.
Проделайте это в квадруплексе, чтобы получить в общей сложности восемь реакций D-связывания на образец. Для каждого тестируемого образца сделайте дополнительный набор реакций DI-связывания с использованием белка из контрольной группы, например, из больного мозга. Затем для каждой пары реакций настройте внутреннюю реакцию контроля с 400 пикомолами CY-2 и четным представлением всех белков общим объемом 250 микрограммов.
Маркировка SAI достигается путем инкубации всех реакционных смесей при четырех градусах Цельсия в темноте в течение часа. После инкубации соедините все наборы трех различных голубых реакций в объемы по 150 микролитров к каждому набору реакций в 200 микролитрах 2D-буфера. Затем перейдите к этапам 2D-электрофореза.
Начните с приготовления немеченых белковых растворов для препаративного геля, из которого будут вырезаться белковые пятна для каждого образца и для положительного контроля. Добавьте от 300 до 350 микрограммов немеченого белка в 2D-буфер и дайте им возможность регидратироваться при контакте с полоской IPG. Затем загрузите полоски IPG, перенесите меченый и немеченый белок на регидратацию.
Ну а затем накройте каждую лунку реакционной полоской IPG. После этого нанесите слой минерального масла и дайте полоскам пассивно пассивно регидратироваться с помощью белкового раствора в течение ночи при температуре не более 25 градусов Цельсия. На следующий день проводят изоэлектрическую фокусировку полос IPG.
Затем удалите масло и храните полоски IPG при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы сбалансировать полоски IPG. Погрузите их в уравновешивающий буфер на 15 минут. Затем перенесите полоски на 4,7% ацетамид IDO в уравновешивающий буфер, не содержащий DTT во время купания полосок.
Используйте большую 2D-гелевую систему, чтобы залить четыре 12%-ных геля SDS на образец в стеклянные пластины с низкой флуоресценцией для меченых белков. Также налейте по одному 12%-ному гелю SDS в стандартные стеклянные пластины толщиной 1,5 миллиметра для каждого из немеченных белков. Это препараты гелей.
Когда гели остынут, перенесите полоски в верхнюю часть гелей и наложите на них 0,5% Aros после охлаждения, запустите гели мощностью 2,5 Вт при четырех градусах Цельсия на ночь и проанализируйте их на следующий день. Многие 2D-реакции могут быть проведены с образцами белка, используемыми для препаративных гелей. Отмерьте менее 100 микрограммов образца на 200 микролитров 2D-буфера.
Затем энергично перебейте смеси образцов и дайте им быстрый открут. Загрузите образцы на 11-сантиметровые полоски IPG и дайте им пассивно увлажниться в течение ночи, покрытые минеральным маслом на следующий день. Выполните изоэлектрическую фокусировку.
Затем проведите полоски через три ванны уравновешивающего буфера в течение 15 минут на ванну. Затем полоски наносятся на гели для страниц 2D SDS. Нанесите каждую полоску на сборный гель с соответствующей молекулярной массой.
Полиакриламид для интересующего белка. Позже перенесите гели на мембрану NITROCELLULOSE PVDF и проанализируйте их на антитела для разработки этого протокола. Три разных лизиса.
Были протестированы буферы. Во-первых, общий биохимический и молекулярно-биологический буфер. Испытания прошли испытания Tris SDS.
Tris SDS имел низкое разрешение по сравнению с другим тестируемым буферным UTS. Третий буфер для de был исключен, так как с его помощью не могли быть приготовлены тестируемые образцы. Затем были исследованы протеомы мозга человека и мыши.
Сравнивались образцы контрольной коры головного мозга человека и образцы коры головного мозга. Белки мозга мышей у мышей с патологией БА, подобной тау-патологии, также были изучены на примере человека. SCI 2 рассматривался независимо друг от друга, как и S SI 3 и sci 5 для каждого D. Высокое разрешение пятна облегчало выравнивание.
Для исследования посттрансляционных модификаций был использован качественный мини-2D-анализ, и было обнаружено, что лигаментизационный альфа-синуклеин в тканях AD имеет нормальный профиль, но также обнаруживается в виде димера, отмеченного звездочкой. Стрелками отмечено, где был обнаружен альфа-синуклеин. Убиквитинированный белок-предшественник амилоида также рассматривался с помощью мини-2D.
Спорадическое объявление сравнивалось с семейным объявлением. В семейном бета-амилоиде от одного до 42 и дисперсия ISO ниже по концентрации, потому что формы лиги были обнаружены при концентрации в восемь килодальтон. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать протеом, чтобы сравнивать сложные образцы путем измерения модификаций экспрессии белка.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование сосредоточено на извлечении белков из тканей мозга человека и мыши с использованием общепринятой буферной смеси для протеомного анализа. Метод позволяет идентифицировать и характеризовать белки с помощью передовых техник электрофореза.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Протеомика
- Нейробиология
- Биохимия
Бакграунд
- Извлечение белков важно для понимания функций мозга.
- Двухмерные электрофоретические техники улучшают разделение белков.
- Послепереводные модификации могут значительно влиять на функции белков.
- Необходимы надежные методы для получения воспроизводимых результатов в биопсиях и моделях.
Цель исследования
- Извлечь белки из тканей мозга для анализа.
- Использовать двухмерную флуоресцентную разностную гель-электрофорез.
- Идентифицировать послепереводные модификации с помощью иммуноблоттинга.
Используемые методы
- Извлечение белков с использованием буфера из мочевины/тиомочевина/СДС.
- Двухмерная флуоресцентная разностная гель-электрофореза (2D-DIGE).
- Мини 2D гель-электрофорез для иммуноблоттинга.
- Масс-спектрометрия для идентификации белков.
Основные результаты
- Успешное извлечение белков из тканей мозга человека и мыши.
- Идентификация белков с помощью масс-спектрометрии.
- Характеристика послепереводных модификаций.
- Повышенная воспроизводимость результатов из биопсий и моделей.
Выводы
- Метод обеспечивает надежные результаты для протеомного анализа.
- Он способствует изучению экспрессии белков и их модификаций.
- Этот подход может быть применен к различным неврологическим исследованиям.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
