Картирование дисфункциональных белок-белковых взаимодействий при заболевании

Наша работа картирует дисфункциональные взаимодействия белков и белков непосредственно из нативных клеток и тканей, показывая, как болезни перестраивают клеточные сети. В отличие от большинства межатомных методов, dfPPI не требует генной инженерии и навыков для пациентов, используя один мультиплексный захват на каждый образец. Для начала подготовьте буфер для экстракции белка, содержащий 20 миллимолярных трис, 20 миллимолярных хлорида калия, 5 миллимолярных хлорида магния и 0,01% Nb-40.

Добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы непосредственно перед употреблением и держите буфер на ледяном состоянии. Поместите образец замороженной ткани в микротканевую гомогенизаторную трубку с пестиком. Добавьте 500–700 микролитров натурального буфера для лизис, регулируя объём с учётом компактности ткани и удобства гомогенизации.

Затем уберите образец на льду, аккуратно двигая пестиком вверх, вниз и по абразивным стенкам, пока не получится равномерная подвеска. Инкубировать лизаты при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут, поместив флакон на вращательный блок. Аккуратно смешивайте образцы во время инкубации через вращение.

Используя настольную центрифугу, центрифугуйте образцы при 13 000 G в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Аккуратно соберите супернатанты и переместите их в прозрачные микроцентрифугные пробирки объёмом 1,5 миллилитра. Определите общую концентрацию белка в супернатанте с помощью набора BCA Assay Kit согласно инструкциям производителя.

Далее возьмите аликвот полиуретановых шариков прямо из изопропанола. Дайте бусинам осесть, чтобы удалить растворитель для хранения. Аккуратно аспирируйте изопропанол, затем добавьте нативный лизисный буфер и полностью подвесьте шарики с помощью мягкой пипетки или инверсии.

Чтобы промыть и уравновесить бусины, закрутите трубку, а затем центрифугайте её. После этого аспирируйте супернатант с помощью вакуумной линии с наконечником пипетки, стараясь не потревожить гранулу. Добавьте буфер для переплёта в вымытых бусиках в равном пропорции, чтобы получить однородную рабочую суспензию.

Аликвотируйте 40 микролитров полиуретановой бусинки в микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 миллилитра, используя наконечник пипетки для плавного дозирования. Затем три раза промой буфер с натуральным лизисным буфером, добавив 1 миллилитр буфера в каждую трубку. Закрутите трубку, чтобы снова подвесить шарики, затем центрифугировать при 10 000 G на 1 минуту и сбросить супернатант аспирацией.

После окончательной промывки удалите большую часть оставшейся жидкости из трубок, убедившись, что шарик не тронут. Добавьте нормализованные белковые экстракты в отдельные 1,5-миллилитровые микроцентрифугные пробирки, содержащие 40 микролитров контрольной бусины. Отрегулируйте итоговый объём до 250 микролитров, добавив соответствующее количество нативного буфера для лизис.

Инкубировать образцы при 4 градусах Цельсия в течение 30 минут с вращением на вращающем механизме, работающем со скоростью 10-15 оборотов в минуту. Центрифугуйте трубки при 10 000 г в течение 1 минуты при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать контрольные шарики вместе с агрегированными или нерастворимыми белками. Аккуратно соберите супернатант из контрольных шариков с помощью 1-миллилитровой пипетки и переложите его в свежие 1,5-миллилитровые трубки с 40 микролитрами промытой полиуретановой бусинки.

Инкубировать образцы при 4 градусах Цельсия в течение 3 часов с вращением на ротаторе с концом в конец. После тщательного центрифугания трубок аспирируете супернатант и промывайте бусины четыре раза, как было показано ранее. Удалите остатки PBS из трубки.

Промытые шарики снова суспензируются в 80 микролитрах 2-молярной мочевины, свежеприготовленной в 50-миллимолярном аммонийном бикарбонате при pH 8,5, путем пипетирования или кратковременного вихрения. Затем добавьте дитиотрейтол, чтобы получить итоговую концентрацию 1 миллимоляр. После закрытия трубки инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с встряхиванием при 1 100 оборотах в минуту на нагретом орбитальном шейкере.

Добавьте йодоацетамид для достижения конечной концентрации 3,67 миллимоляра. Инкубировать трубки в темноте при комнатной температуре 45 минут с встряхиванием при 1100 оборотах в минуту. Теперь добавьте дополнительный дитиотрейтол, чтобы закалить неотреагированный йодоацетамид, обеспечив конечную концентрацию 3,67 миллимоляра, и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.

Добавьте в образец 750 нанограммов протеазы Lys-C масс-спектрометрического класса с масс-спектрометрией по количеству 0,5 миллиграмма на миллилитр. Инкубировать смесь при 37 градусах Цельсия в течение часа с встряхиванием при 1 150 оборотах в минуту. Далее добавьте в образец 750 нанограммов свежеприготовленного трипсина с концентрацией 0,5 миллиграмма на миллилитр для секвенирования.

Инкубировать смесь на ночь при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 1 150 оборотах в минуту. На следующий день центрифугуйте образец при 1 000–5 000 г в течение 1-5 минут при комнатной температуре. Аккуратно переведите супернатант в свежую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра с помощью пипетки и сбросьте бусины.

Скорректируйте pH диджеджеста ниже 3, добавляя 50% трифторуксусной кислоты по каплям. Проверьте pH с помощью индикаторных полосок. PU-шарики сильно захватили HSP90, HSC70 и горячие белки из эпихаперома с высоким содержанием лизата с минимальным сигналом от эпихаперома с низким содержанием лизата, подтверждая биологическую специфичность зонда.

Профиль груза PU-шарика показал насыщенный, высокомолекулярный сигнал в полосе PU-шариков и минимальный фон в контрольной полосе бусин, что подтверждало успешную активность зонда. Гели SDS-PAGE с окрашением Кумасси показали равномерное распределение полос по четырём образцам, обработанным в геле, что подтверждает успешное обогащение белковых комплексов из нативных лизатов до масс-спектрометрии. Техническая воспроизводимость была подтверждена анализом основных компонентов, при котором реплицированные образцы плотно сгруппированы, а разные образцы отделялись чисто.

Распределение интенсивности ионов предшественников показало, что у большинства признаков коэффициенты вариации ниже 20% с медианными значениями от 9,7% до 11,9% по образцам, что подтверждает согласованное обнаружение и восстановление пептидов. Иерархическая кластеризация лог-трансформированных белков выявила сильное разделение образцов и сохранение межобразной вариации с интенсивностью белков, варьирующимися от низкого количества до высокообогащённых белков. Анализ обогащения путей продемонстрировал широкое охват аннотаций по нескольким онтологиям, включая категории онтологий генов и курируемые базы данных, такие как Reactome, KEGG и WikiPathways.

dfPPI позволил нам открыть механистические и терапевтические инсайты, до которых другие подходы просто не могут достичь. dfPPI выводит интеромику на уровень реальных когорт заболеваний и местных условий, позволяя строить точные механистические и терапевтические гипотезы. Сейчас мы расширяем dfPPI, чтобы картировать изменения на уровне сетей при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона.