Настройка простого Light Лист микроскоп для В Тото Визуализация С. Элеганс Разработка
5 мая 2014 г.
Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов.
Общая цель этой процедуры — получить изображение развития C. Allergan с помощью флуоресцентной световой листовой микроскопии. Это достигается путем предварительной настройки микроскопа на основе светового листа, состоящего из вертикального микроскопа и небольшого набора оптомеханических элементов для создания светового листа. Вторым этапом процедуры является монтирование эмбриона.
Последними шагами являются регулировка светового листа на эмбрионе и запись его развития. Полученные результаты могут показать динамику флуоресцентно меченых белков в процессе развития CL egan с помощью анализа 3D и таймлапс-видео. Основные преимущества легкой микроскопии перед другими существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, заключаются в том, что она позволяет получать более быстрые изображения с меньшей фототоксичностью.
В-третьих, этот метод может дать представление о противодействии развитию. Он также может быть применен к другим системам, таким как ройл или данио. Демонстрация процедуры будет понятна.
Шейлз, инженер из моей лаборатории, и Полин Линак, инженер из лаборатории фургона. В этом разделе описывается сборка установки, и ее можно оставить собранной для всех экспериментов. После того, как лазеры, фильтры, телескоп и перископ будут размещены на оптическом столе, закрепите цилиндрическую линзу для создания светового слоя.
Для фокусировки настраивается другой объектив. Фокусная точка объектива освещения должна совпадать с фокусной точкой объекта объектива обнаружения. Теперь спроецируйте луч на стену или экран и перемещайте объектив освещения вдоль оси луча до тех пор, пока контуры проекции не станут четкими.
Включите в комплект микроскопа четырехлинейный фильтр излучения и камеру E-M-C-C-D. Закрепите второй этап ручного перевода на первом перпендикулярно. Прикрутите узел к имеющемуся предметному столику для микроскопа.
Сняв установленный цилиндрический объектив для подсветки, поместите его на микроскоп и установите набор подсветки обратно на столики. Установите держатель qve на перпендикулярном пересечении пути освещения и пути обнаружения. Теперь проверьте световой лист.
Заполните стекло вете раствором флуоресцеина и поместите его в держатель на столиках. Световой лист должен быть виден. Он должен быть горизонтальным и центрированным по отношению к линзе объектива обнаружения.
Далее снимаем цилиндрическую линзу. Оптимизируйте световой лист с помощью 3D-трансляции объектива освещения и получите изображение для измерения толщины светового полотна. Это зависит от диафрагмы объектива.
Затем обязательно замените цилиндрическую линзу. Сначала отрежьте кусок стекла толщиной в один миллиметр, 10 миллиметров на 20 миллиметров. Используйте маркер с бриллиантовой маркировкой.
Затем добавьте 20 микролитров поли-ллизина с одной стороны и, когда он высохнет, сопоставьте его со вторым предметным стеклом. В неподвижном положении добавьте каплю 5%агара и разровняйте ее под тяжестью третьей горки, установленной сверху. После того, как агар высохнет, снимите третье предметное стекло и разрежьте агаровую прокладку в трех миллиметрах от края двух оставшихся слайдов над горкой без поли Л лизина.
Затем снимите неподвижную заслонку, оставив свес из агара. Смажьте агар 20 микролитрами поли Л лизина и дайте ему высохнуть. Теперь поместите червей GR в стекло часов, наполненное средой M nine, под микроскопом для вскрытия.
Разрежьте червей скальпелем до уровня вульвы, выпустив таким образом яйца. Затем определите эмбрионы, которые представляют интерес и соберите их с помощью микрокапиллярной пипетки. Переносите зародыши на выступ агара с подготовленного предметного стекла как раз рядом с краем горки, а не на границе агара.
Затем выровняйте эмбрионы с помощью микрокапиллярной пипетки, одновременно удаляя жидкость. При аспирации эмбрионы будут прилипать к полиоллизину. Очень важно правильно расположить эмбрионы для получения хорошей записи, а для этого требуется капилляр с правильным аптурой.
Если они слишком малы, будет трудно выпустить эмбрионы. Если слишком большой, будет трудно точно контролировать утечку потока и выровнять эмбрионы, накройте предметное стекло средой M nine в чашке Петри и убедитесь, что эмбрионы все еще прикреплены к агару с помощью увеличения. Теперь закрепите подготовленное предметное стекло с эмбрионами на держателе образца, который помещается в вету.
Держатель представляет собой приспособление собственного производства, которое предназначено для установки на ветру. Затем закрепите вете на электрическом столике Pizo и при ярком освещении найдите эмбрион. Теперь запустите программный комплекс, управляющий акустической оптической перестройкой.
Фильтруйте камеру и сцену. Это программное обеспечение было написано собственными силами, но также можно использовать бесплатное программное обеспечение для микроменеджера. Для начала выберите лазерную линию.
Затем отрегулируйте рабочую область по оси x до тех пор, пока световой лист не станет наиболее ярким. Затем отрегулируйте два других измерения, Y и Z, пока сигнал к шуму не достигнет наилучшего уровня. Возможно, это придется повторить для каждого эмбриона.
Этот ключ к оптимизации соотношения сигнал к получению хорошей записи ly трансляции свободной стадии, поддержки и устранения цели, когда я просто связан с получением точной симуляции эмбриона и наилучшим контрастом. Теперь для получения покадровых изображений установите мощность лазера, коэффициент усиления и интервал визуализации в соответствии с уровнем флуоресценции эмбриона и скоростью анализируемого биологического процесса. Для Зака.
Визуализация задает расстояние между срезами и их начальную и конечную позиции в celgan, выражая гистоновую конструкцию GFP. Двухчасовая покадровая съемка была сделана с 20 стеками срезов, сделанных каждые 37 секунд. Клеточные деления были хорошо видны у штамма, экспрессирующего тубулин, слитый с GFP, и его камень сросшийся с m вишней. Записи делались в течение 16 минут каждые 105 секунд.
3D-визуализация показывается в трех временных точках. Митотические веретена и конденсированные хромосомы хорошо видны и легко отслеживаются через клеточные деления. В третьем штамме APO липопротеин вит два, слитый с GFP, был визуализирован с помощью мечения клеточной мембраны mCherry.
В течение 13 минут каждые 27 секунд делалось 10 срезов. За быстро движущимися частицами липопротеинов было легко уследить. Здесь мы используем для производства световой лист, сформированный более сложными методами.
Световой лист может быть реализован для дальнейшего улучшения пространственного разрешения.
Обзор
Этот протокол описывает настройку микроскопа светового листа и его использование для in vivo визуализации эмбрионов C. elegans. Метод позволяет более быстрое изображение с меньшей фототоксичностью по сравнению с конфокальной микроскопией.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Микроскопия
Бакграунд
- Микроскопия светового листа предоставляет уникальный подход к визуализации биологических образцов.
- Эта техника особенно полезна для наблюдения живых эмбрионов.
- Это минимизирует фотоповреждения, позволяя быстрое изображение.
- Применение распространяется на различные модельные организмы за пределами C. elegans.
Цель исследования
- Визуализировать развитие эмбрионов C. elegans с использованием флуоресцентной микроскопии светового листа.
- Анализировать динамику флуоресцентно метченых белков во время развития.
- Демонстрировать преимущества микроскопии светового листа перед традиционными методами.
Используемые методы
- Настройка микроскопа светового листа с оптомеханическими элементами.
- Установка эмбрионов на подготовленные слайды с агар-агар пастами.
- Оптимизация выравнивания светового листа для визуализации.
- Тайм-лапс визуализация эмбрионов для захвата процессов развития.
Основные результаты
- Успешная визуализация клеточного деления и динамики белков в эмбрионах C. elegans.
- Получены 3D рендеры митотических веретенов и хромосом.
- Демонстрирована возможность отслеживания быстро движущихся белков.
- Получены данные о процессах развития организма.
Выводы
- Микроскопия светового листа является мощным инструментом для in vivo визуализации.
- Этот метод улучшает понимание эмбрионального развития.
- Он может быть адаптирован для использования с другими модельными организмами.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
