Настройка простого Light Лист микроскоп для В Тото Визуализация С. Элеганс Разработка

Общая цель этой процедуры — получить изображение развития C. Allergan с помощью флуоресцентной световой листовой микроскопии. Это достигается путем предварительной настройки микроскопа на основе светового листа, состоящего из вертикального микроскопа и небольшого набора оптомеханических элементов для создания светового листа. Вторым этапом процедуры является монтирование эмбриона.

Последними шагами являются регулировка светового листа на эмбрионе и запись его развития. Полученные результаты могут показать динамику флуоресцентно меченых белков в процессе развития CL egan с помощью анализа 3D и таймлапс-видео. Основные преимущества легкой микроскопии перед другими существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, заключаются в том, что она позволяет получать более быстрые изображения с меньшей фототоксичностью.

В-третьих, этот метод может дать представление о противодействии развитию. Он также может быть применен к другим системам, таким как ройл или данио. Демонстрация процедуры будет понятна.

Шейлз, инженер из моей лаборатории, и Полин Линак, инженер из лаборатории фургона. В этом разделе описывается сборка установки, и ее можно оставить собранной для всех экспериментов. После того, как лазеры, фильтры, телескоп и перископ будут размещены на оптическом столе, закрепите цилиндрическую линзу для создания светового слоя.

Для фокусировки настраивается другой объектив. Фокусная точка объектива освещения должна совпадать с фокусной точкой объекта объектива обнаружения. Теперь спроецируйте луч на стену или экран и перемещайте объектив освещения вдоль оси луча до тех пор, пока контуры проекции не станут четкими.

Включите в комплект микроскопа четырехлинейный фильтр излучения и камеру E-M-C-C-D. Закрепите второй этап ручного перевода на первом перпендикулярно. Прикрутите узел к имеющемуся предметному столику для микроскопа.

Сняв установленный цилиндрический объектив для подсветки, поместите его на микроскоп и установите набор подсветки обратно на столики. Установите держатель qve на перпендикулярном пересечении пути освещения и пути обнаружения. Теперь проверьте световой лист.

Заполните стекло вете раствором флуоресцеина и поместите его в держатель на столиках. Световой лист должен быть виден. Он должен быть горизонтальным и центрированным по отношению к линзе объектива обнаружения.

Далее снимаем цилиндрическую линзу. Оптимизируйте световой лист с помощью 3D-трансляции объектива освещения и получите изображение для измерения толщины светового полотна. Это зависит от диафрагмы объектива.

Затем обязательно замените цилиндрическую линзу. Сначала отрежьте кусок стекла толщиной в один миллиметр, 10 миллиметров на 20 миллиметров. Используйте маркер с бриллиантовой маркировкой.

Затем добавьте 20 микролитров поли-ллизина с одной стороны и, когда он высохнет, сопоставьте его со вторым предметным стеклом. В неподвижном положении добавьте каплю 5%агара и разровняйте ее под тяжестью третьей горки, установленной сверху. После того, как агар высохнет, снимите третье предметное стекло и разрежьте агаровую прокладку в трех миллиметрах от края двух оставшихся слайдов над горкой без поли Л лизина.

Затем снимите неподвижную заслонку, оставив свес из агара. Смажьте агар 20 микролитрами поли Л лизина и дайте ему высохнуть. Теперь поместите червей GR в стекло часов, наполненное средой M nine, под микроскопом для вскрытия.

Разрежьте червей скальпелем до уровня вульвы, выпустив таким образом яйца. Затем определите эмбрионы, которые представляют интерес и соберите их с помощью микрокапиллярной пипетки. Переносите зародыши на выступ агара с подготовленного предметного стекла как раз рядом с краем горки, а не на границе агара.

Затем выровняйте эмбрионы с помощью микрокапиллярной пипетки, одновременно удаляя жидкость. При аспирации эмбрионы будут прилипать к полиоллизину. Очень важно правильно расположить эмбрионы для получения хорошей записи, а для этого требуется капилляр с правильным аптурой.

Если они слишком малы, будет трудно выпустить эмбрионы. Если слишком большой, будет трудно точно контролировать утечку потока и выровнять эмбрионы, накройте предметное стекло средой M nine в чашке Петри и убедитесь, что эмбрионы все еще прикреплены к агару с помощью увеличения. Теперь закрепите подготовленное предметное стекло с эмбрионами на держателе образца, который помещается в вету.

Держатель представляет собой приспособление собственного производства, которое предназначено для установки на ветру. Затем закрепите вете на электрическом столике Pizo и при ярком освещении найдите эмбрион. Теперь запустите программный комплекс, управляющий акустической оптической перестройкой.

Фильтруйте камеру и сцену. Это программное обеспечение было написано собственными силами, но также можно использовать бесплатное программное обеспечение для микроменеджера. Для начала выберите лазерную линию.

Затем отрегулируйте рабочую область по оси x до тех пор, пока световой лист не станет наиболее ярким. Затем отрегулируйте два других измерения, Y и Z, пока сигнал к шуму не достигнет наилучшего уровня. Возможно, это придется повторить для каждого эмбриона.

Этот ключ к оптимизации соотношения сигнал к получению хорошей записи ly трансляции свободной стадии, поддержки и устранения цели, когда я просто связан с получением точной симуляции эмбриона и наилучшим контрастом. Теперь для получения покадровых изображений установите мощность лазера, коэффициент усиления и интервал визуализации в соответствии с уровнем флуоресценции эмбриона и скоростью анализируемого биологического процесса. Для Зака.

Визуализация задает расстояние между срезами и их начальную и конечную позиции в celgan, выражая гистоновую конструкцию GFP. Двухчасовая покадровая съемка была сделана с 20 стеками срезов, сделанных каждые 37 секунд. Клеточные деления были хорошо видны у штамма, экспрессирующего тубулин, слитый с GFP, и его камень сросшийся с m вишней. Записи делались в течение 16 минут каждые 105 секунд.

3D-визуализация показывается в трех временных точках. Митотические веретена и конденсированные хромосомы хорошо видны и легко отслеживаются через клеточные деления. В третьем штамме APO липопротеин вит два, слитый с GFP, был визуализирован с помощью мечения клеточной мембраны mCherry.

В течение 13 минут каждые 27 секунд делалось 10 срезов. За быстро движущимися частицами липопротеинов было легко уследить. Здесь мы используем для производства световой лист, сформированный более сложными методами.

Световой лист может быть реализован для дальнейшего улучшения пространственного разрешения.