Настройка простого Light Лист микроскоп для
5 мая 2014 г.
Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов.
Общая цель данной процедуры — визуализация развития C Allergan с помощью флуоресцентной светолистной микроскопии. Для этого сначала настраивается светолистный микроскоп, состоящий из вертикального микроскопа и небольшого набора оптомеханических элементов для создания светового листа. Вторым этапом процедуры является монтаж эмбриона.
Заключительными этапами являются настройка светового листа на эмбрион и запись процесса его развития. Результаты позволяют проследить динамику флуоресцентно меченных белков в ходе развития C. elegans путем анализа 3D-видео и видео с временным интервалом (time-lapse). Основным преимуществом светолистной микроскопии по сравнению с другими существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, является возможность более быстрого получения изображений при более низкой фототоксичности.
В-третьих, данный метод позволяет получить представление о развитии у тюленей. Его также можно применить к другим системам, таким как карп или zebrafish. Демонстрация процедуры обеспечит наглядность.
Шейлс, инженер из моей лаборатории, и Полин Линак, инженер из лаборатории Ван. В данном разделе описывается сборка установки; она может оставаться собранной для всех экспериментов. После того как лазеры, фильтры, телескоп и перископ будут размещены на оптическом столе, закрепите цилиндрическую линзу для создания светового листа.
Отрегулируйте фокус другого объектива. Фокусное расстояние осветительного объектива должно совпадать с фокусным расстоянием детектирующего объектива. Теперь спроецируйте луч на стену или экран и перемещайте осветительный объектив вдоль оси луча до тех пор, пока контуры проекции не станут четкими.
Добавьте в конфигурацию микроскопа четырехлинейный эмиссионный фильтр и EMCCD-камеру. Закрепите второй ручной translational-столик перпендикулярно первому. Прикрутите полученную сборку к существующему предметному столику микроскопа.
После снятия установленного цилиндрического осветительного объектива поместите узел на микроскоп и установите осветительный комплект обратно на предметные столики. Закрепите держатель qve в точке перпендикулярного пересечения пути освещения и пути детектирования. Теперь проверьте световой лист.
Наполните стеклянную кювету раствором флуоресцеина и поместите ее в держатель на предметном столике. Световой лист должен быть виден. Он должен располагаться горизонтально и быть центрирован относительно детектирующего объектива.
Затем снимите цилиндрическую линзу. Оптимизируйте световой лист с помощью 3D-перемещения осветительного объектива и получите изображение для измерения толщины светового листа. Этот параметр зависит от апертуры линзы объектива.
Затем обязательно замените цилиндрическую линзу. Сначала вырежьте кусок стекла толщиной 1 мм размером 10 мм на 20 мм. Используйте алмазный резец.
Затем нанесите 20 µL поли-L-лизина на одну сторону предметного стекла и, после высыхания, приложите его к второму стеклу. В фиксированном положении добавьте каплю 5% агара и разровняйте её, прижав сверху третьим предметным стеклом. После высыхания агара снимите третье стекло и вырежьте агаровую подушечку на расстоянии 3 мм от края двух оставшихся стекол над тем стеклом, на которое не наносили поли-L-лизин.
Затем снимите фиксированный предметный слайд так, чтобы остался выступающий слой агара. Нанесите на агар 20 µl поли-L-лизина и дайте ему высохнуть. Теперь поместите червей GR в чашку Петри с среде M9 под диссекционным микроскопом.
Рассеките червей скальпелем на уровне вульвы, чтобы высвободить яйца. Затем определите эмбрионы интересующей стадии и соберите их с помощью микрокапиллярной пипетки. Перенесите эмбрионы на выступающую часть агара подготовленного предметного стекла, непосредственно рядом с краем стекла, но не на границу агара.
Затем с помощью микрокапиллярной пипетки выровняйте эмбрионы, одновременно удаляя жидкость. За счет аспирации эмбрионы прикрепятся к полилизину. Для получения качественной записи крайне важно правильно расположить эмбрионы, что требует использования капилляра с подходящим отверстием.
Если отверстие будет слишком маленьким, извлечь эмбрионы будет затруднительно. Если слишком большим — будет сложно плотно контролировать поток жидкости и выравнивать эмбрионы. Поместите предметное стекло с эмбрионами в чашку Петри с единой средой M9 и под увеличением убедитесь, что эмбрионы всё еще прикреплены к агару. Теперь закрепите подготовленное предметное стекло с эмбрионами в держателе для образцов, подходящем для установки в вете.
Держатель представляет собой устройство собственной разработки, предназначенное для установки в vete. Затем закрепите vete на пьезоэлектрическом столике и при светлопольном освещении найдите эмбрион. Теперь запустите программный пакет, управляющий акустооптическим перестраиваемым фильтром.
Отфильтруйте изображение с камеры и предметного столика. Данное программное обеспечение было разработано внутри нашей организации, однако также можно использовать бесплатное ПО MicroManager. Сначала выберите линию лазера.
Затем перемещайте предметный столик вдоль оси x до достижения максимальной яркости светового листа. После этого отрегулируйте положение по двум другим осям, Y и Z, для достижения наилучшего соотношения сигнал/шум. Возможно, эту процедуру потребуется повторить для каждого эмбриона.
Этот ключ позволяет оптимизировать соотношение сигнал/шум для получения качественной записи, обеспечивая при этом перевод свободного этапа, поддержку и устранение целей, когда я просто соотношу их для получения точной симуляции эмбриона и наилучшего контраста. Теперь для получения серии изображений в режиме таймлапс установите мощность лазера, время экспозиции, усиление и интервал съемки в соответствии с уровнем флуоресценции эмбриона и скоростью анализируемого биологического процесса. Для Зака.
При проведении визуализации установили расстояние между срезами, а также их начальное и конечное положение в клетках, экспрессирующих гистоновую конструкцию GFP. В течение двух часов проводилась тайм-лапс визуализация со стеками из 20 срезов, снимаемых каждые 37 секунд. Деление клеток было четко видно в штамме, экспрессирующем тубулин, слитый с GFP, и гистон, слитый с m cherry. Записи проводились в течение 16 минут каждые 105 секунд.
Представлены 3D-реконструкции в трех временных точках. Митотические веретена и конденсированные хромосомы четко видны, что позволяет легко отслеживать их в процессе деления клеток. В третьем штамме проводилась визуализация белка APO lipoprotein vit two, слитого с GFP, при одновременном мечении клеточной мембраны mCherry.
В течение 13 минут каждые 27 секунд выполнялась серия из 10 срезов. Быстродвижущиеся частицы липопротеинов было легко отслеживать. Здесь мы используем световой лист, сформированный с помощью более сложных методов получения.
Для дальнейшего повышения пространственного разрешения может быть использован световой лист.
Обзор
В данном протоколе описывается настройка плоскостного светового микроскопа (light sheet microscope) и его применение для визуализации эмбрионов C. elegans in vivo. Этот метод обеспечивает более высокую скорость съемки при более низкой фототоксичности по сравнению с конфокальной микроскопией.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Микроскопия
Теоретическое обоснование
- Микроскопия плоскостного освещения предоставляет уникальный подход к визуализации биологических образцов.
- Этот метод особенно полезен для наблюдения за живыми эмбрионами.
- Он сводит к минимуму фотоповреждение, обеспечивая при этом высокую скорость визуализации.
- Области применения распространяются на различных модельных организмов, помимо C. elegans.
Цель исследования
- Визуализация развития эмбрионов C. elegans с помощью флуоресцентной плоскостной микроскопии.
- Анализ динамики флуоресцентно-меченных белков в процессе развития.
- Демонстрация преимуществ плоскостной микроскопии перед традиционными методами.
Используемые методы
- Сборка светолистного микроскопа с использованием оптомеханических элементов.
- Монтаж эмбрионов на подготовленные предметные стекла с агаровыми подушечками.
- Оптимизация юстировки светового листа для визуализации.
- Таймлапс-визуализация эмбрионов для регистрации процессов развития.
Основные результаты
- Успешная визуализация деления клеток и динамики белков в эмбрионах C. elegans.
- Получены 3D-реконструкции митотических веретен и хромосом.
- Продемонстрирована возможность отслеживания быстроподвижных белков.
- Получены новые данные о процессах развития организма.
Выводы
- Микроскопия светового листа является мощным инструментом для визуализации in vivo.
- Данный метод углубляет понимание эмбрионального развития.
- Его можно адаптировать для использования с другими модельными организмами.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Микроскопия светового листа позволяет получать изображения развития целого организма с высоким разрешением и низкой фототоксичностью, что способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска за счет предоставления количественных динамических фенотипических данных. Этот подход снижает биологическую неопределенность в доклинических моделях, позволяя осуществлять лонгитюдное отслеживание клеточных процессов и динамики белков в живых системах. Данный метод повышает прогностическую достоверность при идентификации ведущих соединений, обеспечивая воспроизводимые и масштабируемые результаты визуализации, совместимые с рабочими процессами высококонтентного скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством визуализации динамики белков и клеточного деления в развивающихся эмбрионах с субклеточным разрешением.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков, обеспечивая воспроизводимые количественные показатели фенотипов развития в условиях низкой фототоксичности.
- Прогностическая ценность: упрощает отбор приоритетных проектов за счет создания лонгитюдных многопараметрических наборов данных, которые коррелируют молекулярные возмущения с результатами развития.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированную 3D-визуализацию в режиме таймлапс с субклеточным разрешением, что позволяет надежно оценивать эффект соединений в контексте целого организма.
- Эксплуатационная ценность: гарантирует воспроизводимость анализа за счет точного выравнивания и стабилизации светового листа, сводя к минимуму вариабельность в сессиях лонгитюдной визуализации.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными камерами наблюдения и автоматизированным управлением предметным столиком позволяет проводить кампании по скринингу со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между стадией открытия и доклинической валидацией за счет последовательной фенотипической оценки в различных модельных системах с использованием стандартизированных протоколов визуализации.
- Снижение механистических рисков: позволяет напрямую наблюдать эффекты связывания с мишенью в процессах развития, что уменьшает неопределенность в исследованиях механизма действия.
- Обоснованный перевод на следующие этапы: предоставляет количественные пороги для принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе показателей развития токсичности и метрик нормализации фенотипа.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий цикл разработки лекарственных средств — от ранней валидации мишеней до оптимизации ведущих соединений, предлагая неразрушающий количественный метод визуализации для фенотипического скрининга и изучения механизмов действия на моделях целого организма.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет возможности отслеживания в реальном времени флуоресцентно меченных белков и клеточных структур в процессе эмбриогенеза.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к проведению анализа благодаря стандартизированным протоколам подготовки предметных стекол, характеризации светового листа и монтирования эмбрионов, что гарантирует согласованность визуализации.
- Аналитика: Позволяет получать количественные 3D-данные и результаты таймлапс-съемки (например, динамику веретена деления, трафик белков), что обеспечивает объективное сравнение различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность доклинических исследований, предоставляя релевантные для конкретных заболеваний фенотипические показатели на *C. elegans*, которая является валидированной моделью консервативных путей развития.
- Корпоративное использование: Система спроектирована как модульная конструкция с левосторонней сборкой на оптическом столе, что позволяет многократно использовать ее в различных проектах с минимальной рекалибровкой.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности путем прямого лонгитюдного наблюдения за динамикой белков и поведением клеток.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным процедурам оптомеханического выравнивания, подготовки предметных стекол и монтажа эмбрионов.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения раннего выявления нарушений развития (тератогенности), что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за невыявленных биологических рисков.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков за счет получения количественных фенотипических показателей на основе визуализации, которые обосновывают решения о дальнейшем продвижении различных классов мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области юстировки оптики, флуоресцентной микроскопии и подготовки образцов для прижизненной визуализации.
- Необходимы стабильный оптический стол, лазерные источники, объективы, столы перемещения, а также EM-CCD или sCMOS камера для детектирования.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки предметных стекол, определения стадии развития эмбрионов и параметров визуализации для обеспечения воспроизводимости результатов разными пользователями и на разных площадках.
- При распространении метода на другие модельные системы (например, zebrafish, Drosophila) следует учитывать такие факторы, как размер эмбриона, необходимость оптического просветления и совместимость с монтажными средами.
- Практические ограничения включают эффективность иммобилизации эмбрионов и равномерность светового листа на больших полях зрения, что может потребовать оптимизации для длительных сеансов визуализации.
