C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений

Общая цель этой комбинации стандартных методов состоит в том, чтобы продемонстрировать, как кишечник C.elegans может быть использован для анализа in vivo биогенеза поляризованной мембраны и морфогенеза просвета на одноклеточном и субклеточном уровне. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области полярности и биогенеза, такие как установление и поддержание апикальных и базолатеральных мембранных доменов и других субклеточных асимметрий во время и после морфогенеза. Основное преимущество этой модельной системы заключается в том, что этот прозрачный одиночный слой, состоящий всего из 20 клеток, может выжить в тканевой камере in vivo для рассечения поляризованной мембраны одной клетки и биогенеза просвета.

Методы могут быть распространены на анализ других фенотипов морфогенеза C.Elegans, основное внимание здесь уделяется анализу мембранного биогенеза, в частности, биогенеза апикальной мембраны и просвета. Процедуры включают в себя усовершенствованные методы визуализации у неподвижных и живых животных для различения мембранных доменов и субклеточных компонентов, а также для идентификации фенотипов морфогенеза просвета в кишечнике C.elegans. Данное видео по кишечному тубулогенезу сопровождается видео о взаимно информативных моделях тубулогенеза выводных каналов, в котором проведен in vivo анализ биогенеза поляризованных мембран.

Что касается мечения, то генерация трансгенных животных флуоресцентно мечеными гибридными белками для визуализации в реальном времени описана в сопроводительном видео, посвященном анализу тубулогенеза выводных каналов. Такие животные могут быть непосредственно использованы в экспериментах с РНК-интерференцией. Третье поколение, как правило, является первым шагом в этой комбинации процедур.

Это видео начинается с альтернативного метода мечения: окрашивание антителами, для которого животные должны быть зафиксированы. Различные процедуры мечения могут сочетаться с иммуногистохимией, обычно используемой для окончательного визуализирующего анализа. Этот протокол также содержит примеры специфичных для кишечника мембранных маркеров, промоторов и других ресурсов, полезных для обеих процедур маркировки.

После демонстрации иммуногистохимии в этом видео используется трансгенный штамм, который помечает апикальную мембрану кишечника ERM-1 GFP для поиска фенотипов полярности и морфогенеза просвета с помощью РНК-интерференции. Сначала подготовьте горку для фиксации червей. Нанесите пипеткой 30 микролитров поли-L-лизина на предметное стекло, а затем установите второе предметное стекло на другое и опустите их вместе, чтобы равномерно распределить раствор на обоих.

Теперь снимите два предметных стекла и дайте им высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Далее поместите плоский металлический брусок в емкость, наполненную жидким азотом. Промойте пластины раствором М9 и перелейте около 10 микролитров М9, содержащего червей.

В качестве альтернативы выберите червей и добавьте M9 на слайд. После того, как черви будут перенесены, осторожно опустите на них покровный скольжение так, чтобы покровное скольжение свисало с одного края. Затем осторожно нажмите на крышку, не делая никаких боковых движений.

Теперь сразу же перенесите предметное стекло на металлический блок в жидкий азот и дайте ему застыть. Через пять минут снимите чехол с помощью нависающего края. Делайте это быстро, чтобы получить надлежащий щелчок кутикулы.

Далее погрузите предметное стекло в наполненную метанолом стеклянную банку Coplin при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Через пять минут переложите предметное стекло в наполненную ацетоном стеклянную банку Коплина еще на пять минут при той же температуре. Предметные стекла можно окрашивать непосредственно или хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Снимите предметное стекло с ацетона и дайте ему высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Затем отметьте место для круглой стенки из вазелина на нижней стороне предметного стекла, затем постройте стенку из желе. Не стоит оттирать желе во время этой процедуры.

Далее подготовьте влажную камеру в мусорном ведре с влажными бумажными полотенцами и поставьте предметное стекло на решетку внутри. Не должно быть контакта между полотенцами и горкой или между соседними горками. Теперь нанесите пипеткой достаточное количество PBS в желейный круг, чтобы покрыть всю область.

Аккуратно поместите наконечник пипетки на край круга и дайте жидкости плавно распределиться по червям. Затем закройте крышку и подождите пять минут. Через пять минут наклоните горку и медленно отсасывайте ПБС, стараясь не потерять червей с горки.

Далее аккуратно заполните желейный круг свежеприготовленным блокирующим раствором. И дайте горке поинкубироваться в течение 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут замените блокирующий раствор на блокирующий раствор, содержащий первичное антитело.

И инкубируйте горку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день удалите первичное антитело и промойте предметное стекло, нанеся и удалив блокирующий раствор три раза. Дайте каждой блокировке инкубироваться в течение 10 минут.

Далее добавляют вторичное антитело, разведенное в блокирующем растворе и инкубируют предметное стекло в течение часа при комнатной температуре. После этого дважды промойте предметное стекло блокирующим раствором, а затем один раз PBS. Затем удалите как можно больше PBS, не давая образцу высохнуть, и осторожно удалите желе вокруг образца.

Нанесите каплю монтажного средства на образец, а затем закройте крышку и запечатайте лак для ногтей. Затем храните предметные стекла в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. Перенесите библиотечную пластину РНК-интерференции из режима минус 80 градусов Цельсия на сухой лед.

Снимите уплотнительную ленту. И перенесите интересующий клон на селективный шнек. Затем измельчите клон и выращивайте бактерии в течение ночи.

Перед тем как вернуть библиотечную тарелку в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию, наклейте новую герметизирующую ленту. На следующий день инокулируйте колонии из тарелки в один миллилитр аликвоты жидкой среды, содержащей ампициллин. Затем встряхивайте их около 14 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день засейте по 200 микролитров на клон на отдельные пластины РНК-интерференции. Дайте планшетам высохнуть и индуцировать выработку РНК-интерференции с помощью ночной инкубации при комнатной температуре. Через день перенесите пять червей стадии L4 на каждую пластину РНК-интерференции, помеченную конкретным геном, который является мишенью.

Затем перенесите планшеты в инкубатор, как правило, при температуре 20 градусов Цельсия. Сначала изучите контрольную группу животных в сравнении с РНК-интерференцией при ярком свете при малом и большом увеличении. Затем изучите животных контрольной группы в сравнении с РНК-интерференцией под флуоресцентным светом под соответствующими фильтрами.

Систематически сканируйте пластину с РНК-интерференцией животных от верхнего левого до нижнего правого угла всей пластины в поисках фенотипов. Ищите животных, представляющих интерес. Для более тщательного изучения выбранных фенотипов РНК-интерференции сосредоточьтесь на кишечнике и используйте зум для оценки фенотипов тубулогенеза и морфогенеза просвета.

Чтобы рассмотреть интересующих червей под конфокальной микроскопией, сначала установите и обездвижите их вручную, сделайте тонкий круг из вакуумной смазки или вазелина на предметном стекле. Слой смазки должен быть тонким не толще 0,1 миллиметра. Далее добавьте в середину круга около 3,5 микролитров 10 миллимолярного азида натрия.

Затем быстро выберите интересующих червей в раствор под микроскопом для препарирования, прежде чем раствор высохнет. Затем аккуратно наклейте покровную пленку и сфотографируйте животных в течение 30 минут. Используйте умеренное давление и под микроскопом убедитесь, что черви не плавают в растворе.

Под конфокальным микроскопом найдите червей при малой мощности и фокусе. Затем используйте объектив для погружения в масло 60 или 100X, чтобы увидеть и визуализировать кишечник. Далее осмотрите животное под флуоресцентным светом с помощью соответствующего канала, чтобы выбрать участки, на которых отображается интересующий клеточный дефект.

Двигайтесь быстро, чтобы избежать фотообесцвечивания. Затем переключитесь на лазерное сканирование и ограничьте изображение кишечником, установив границы сканирования на его дорсальной и вентральной стороне. Захватите серию изображений, а затем объедините их в одно проекционное изображение.

В этом протоколе описывается, как молекулярно анализировать и визуально препарировать биогенез поляризованной мембраны в развивающемся кишечнике C.elegans, где морфогенез апикальной мембраны и просвета совпадают. Апикальные и базолатеральные мембранные домены, мембранные соединения и просвет кишечника могут быть разрешены, а их отношение друг к другу может быть изучено на протяжении всего развития. Эти субклеточные компоненты могут быть помечены флуоресцентно меченными антителами или флуоресцентными гибридными белками для двойного или тройного мечения, как описано в сопроводительной статье.

Грубые дефекты просвета могут быть быстро отсканированы с помощью препарирующего флуоресцентного микроскопа. Линкер цитоскелета апикальных мембран ERM-1, связанный с GFP, является мощно экспрессированным маркером, полезным для скрининга РНК-интерференции. При использовании этого маркера был обнаружен ряд новых фенотипов просвета кишечника и полярности, а также лежащие в их основе дефекты генов.

Затем изображения с более высоким увеличением, полученные с помощью конфокального лазерного сканирования, были использованы для более тщательного изучения фенотипов и лучшего понимания основных дефектов. Некоторые фенотипы могут быть количественно определены. Количественная оценка использовалась для сравнения таких дефектов и отслеживания их развития в процессе разработки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как маркировать кишечные мембраны и эндомембранные компартменты с помощью иммуноокрашивания, а также как анализировать фенотипы функции РНК-интерференции поляризованной мембраны и биогенеза просвета.