Микромасштабные Vortex-помощь электропоратора для последовательного молекулярной Доставка

Общая цель этой процедуры заключается в доставке различных типов биологически значимых молекул последовательным и контролируемым дозированием способом с высокой эффективностью с использованием микрофлюидного порера Vortex, что достигается путем предварительного приготовления четырех 50-миллилитровых центрифужных пробирок, индивидуально содержащих растворы DPBS с клетками и биомолекулами, и присоединения каждой пробирки к соответствующему держателю флакона, подключенному к пневматической системе управления потоком. Вторым шагом является вставка входных трубок из каждого соответствующего флакона в микрофлюидное устройство со встроенными 15-контактными электродами. Затем клетки попадают в устройство, где они попадают в микромасштабные вихри, образующиеся в камерах электропорации.

Заключительным этапом является подача коротких электрических импульсов на захваченные клетки с последующим введением растворов, содержащих биомолекулы, которые должны быть доставлены в цитозоль. В конечном счете, клетки, полученные в результате этого процесса, могут быть высвобождены и собраны для последующего анализа. Основное преимущество данной методики перед существующими методами заключается в том, что предложенная методика способна последовательно доставлять контролируемое количество множественных молекул в заранее выбранную идентичную популяцию клеток с высокой эффективностью и жизнеспособностью.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы обмена жидкости трудно изучить из-за времени этапа холодного потока в каждом растворе. Шаг переключения определяет стабильность захвата ячеек. Метастатическая клеточная линия рака молочной железы M-D-A-M-B 2 31 будет использована в этой экспериментальной пластине из расчета от 10 до 10 до пятой клетки на миллилитр в объеме 10 миллилитров на T 75 Колба для культуры тканей в среде Leibovitz L 15 с добавлением 10% объема на объем, фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина.

Стрептомицин инкубируют клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 0% углекислым газом в среде. Через два дня после посева соберите клетки для проведения экспериментов. После промывания клеток буферным фосфатом или DPBS обработайте клетки 0,25% трипсином ЭДТА в течение двух минут.

Добавьте восемь миллилитров питательной среды для инактивации ферментативной активности грануляточных клеток путем центрирования в течение пяти минут при 200-кратном перегрузке и ресуспендируйте среду до конечной концентрации в пять раз по 10 до пятой части клеток на миллилитр. Проектирование и изготовление устройства микрофлюидной электропорации не будет показано в этом видео, но описано в сопроводительной рукописи. Система состоит из входных отверстий для клеток, молекул и промывочного раствора.

Два прямых канала, в которых происходит инерционная фокусировка. 10 камер электропорации с электродами и выходом для установки для проведения экспериментов с потоком. Вставьте выход, полиэфир, эфиркетон или пиковую трубку, а также 15-контактный алюминиевый электрод для подачи короткого импульса высокого напряжения в назначенные места через отверстия в микроканале.

15-контактный электрод состоит из 10 положительных и пяти отрицательных электродов. Каждый положительный электрод находится на расстоянии 1,5 миллиметра друг от друга, а каждый электрод одинаковой полярности находится на расстоянии 1,35 миллиметра друг от друга. Подключите электрооборудование для генерации высоковольтных коротких прямоугольных импульсов к алюминиевым электродам, контактирующим с протекающими растворами.

В форме PDMS оборудование должно состоять из генератора импульсов и высоковольтного усилителя собственной сборки. Приготовьте четыре центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров, по отдельности содержащие DPBS и растворы с клетками и молекулами. Прикрепите каждую пробирку к соответствующему держателю флакона, подключенному к пневматической системе управления потоком.

Подсоедините входную трубку от держателей флаконов к соответствующим входным отверстиям в микрофлюидном устройстве. Далее устанавливаем. Величина прямоугольной волны пульсирует напряжением до 100 вольт.

Для того, чтобы напряженность электрического поля в камере электропорации была эквивалентна 0,7 киловольта на сантиметр. Установите регулятор давления на 40 фунтов на квадратный дюйм, один вручную регулируемый источник азота используется для равномерного нагнетания давления во всех пробирках с образцами и использует высокоскоростной коллектор для своевременной активации отдельных портов раствора. Использование специально разработанного программного обеспечения для управления клапанами в лабораторных условиях.

Откройте программное обеспечение для лабораторного просмотра с надписью «Рабочее колесо клапана» и нажмите «Выполнить» в раскрывающемся меню под названием «Эксплуатация». Нажмите на соответствующий значок клапана один, чтобы открыть клапан для резервуара DPBS для запуска скорости потока, необходимой для стабильной генерации вихря в ловушке ячейки в течение 1,5 минут. Значок клапана должен измениться с серого на зеленый цвет при активации потока как промывки, так и растворов клеток через устройство одновременно в течение 10 секунд до этапа захвата клеток.

Чтобы обеспечить бесперебойный поток на этапе переключения раствора, этот короткий шаг сопотока следует повторять на каждом этапе переключения раствора. Переключите порт активного раствора с промывочного раствора на раствор ячейки, чтобы поймать клетки в камере электропорации на 30 секунд. В этом фильме синие флуоресцентные сигналы представляют собой жизнеспособные крючки.

3, 3, 3, 4, 5 ступенчатые клетки. Включите порт для стирки и промойте устройство в течение 20 секунд. Для удаления не захваченных загрязняющих клеток протекает раствор, содержащий первую интересующую молекулу.

Введите йодид пропидия в прибор для целей визуализации. В этой демонстрации красители нуклеиновых кислот используются вместо флуоресцентно помеченных нитей DExT из-за превосходного отношения шума к сигналу красителей подают пять коротких импульсов сразу после инъекции молекулярного раствора, контролируют величину и количество подаваемых электрических импульсов в режиме реального времени с помощью осциллографа, флуоресцентные сигналы молекул могут быть визуализированы под микроскопом. Инкубируйте клетки в течение 100 секунд в молекулярном растворе. Далее поток, раствор, содержащий вторую молекулу, краситель нуклеиновой кислоты йо-йо внутрь устройства.

В этой демонстрации вторая молекула доставляется без дополнительных электрических импульсов. Этот фильм подтверждает, что клетки теперь экспрессируют все три флуоресцентных сигнала. Зеленый для йо-йо, один, красный для пропидиума, йодида и синий для крючков.

3, 3, 3, 4, 5. Выпустите ячейки в 96-луночную пластину для последующего анализа, снизив рабочее давление ниже пяти фунтов на квадратный дюйм. Из каждого выпуска собирается примерно 100 микролитров раствора со 100 клетками.

Процедуру электропорации необходимо повторить не менее трех раз, чтобы собрать достаточное количество клеток для проточной цитометрической центрифуги. 96-луночный планшет, содержащий клетки, обрабатывается в 228 раз G в течение пяти минут. При комнатной температуре удалите надосадочную жидкость, содержащую избыток флуоресцентных молекул, и ресуспендируйте клетки в DPBS.

Если были доставлены нити DExT, помеченные флуоресцентной меткой, клетки впоследствии анализируются на молекулярное поглощение. Эффективность по данным проточной цитометрии. Успешная молекулярная доставка была качественно определена путем мониторинга изменений интенсивности флуоресценции электропорированных орбитальных клеток в C 2, что подтвердило, что 90% обработанных клеток поглощают молекулу ионной цепи DExT 70 000 Дальтона.

Эффективность для каждой перенесенной молекулы декстрана, определяемая как отношение числа клеток, успешно поглощающих интересующую молекулу, к общему числу обработанных клеток, существенно не изменялась в зависимости от молекулярной массы или электрических зарядов. Все протестированные молекулы декстрана были доставлены в цитозоль с эффективностью более 70%Здесь представлены наши репрезентативные профили проточной цитометрии для клеток, которые не подвергались электропорации. Флуоресцентный порог, указывающий на успешную молекулярную доставку, устанавливается на основе данных таким образом, чтобы сигналы от контрольных образцов находились ниже порога.

Эти репрезентативные данные проточной цитометрии для последовательно электропорированных клеток отображают график проточной цитометрии рядом с изображениями флуоресцентных полос, зеленые прямоугольники представляют сигналы от клеток, поглощающих 3000, только нейтральный декстран Дальтона, а красные прямоугольники представляют сигналы от клеток. Поглощая 3000 Dalton, ионную цепь DExT, поглощая только флуоресцентные сигналы от клеток, обе молекулы цепи DExT, показанные желтым цветом, указывают на эффективность доставки двух молекул в 56% после ее разработки. Эта методика будет полезна исследователям в области медицины, биотехнологии и фармакологии для изучения комбинации терапевтических реагентов для достижения синергетических эффектов при лечении сложных заболеваний.

Не забывайте, что работа с высоковольтными электрическими импульсами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как заземление.