Метилирование специфических мультиплексных капель ПЦР с использованием полимерных капель генератор устройства для гематологической диагностики

Этот протокол представляет собой гибкую мультиплексную капельку PCR рабочий процесс, который позволяет точное дифференциальное количество лейкоцитов на основе эпигенетических маркеров метилирования. Такая гибкость может облегчить перевод mdPCR в сторону клинического использования. Этот метод дает результаты, которые тесно запрос для тех, кто получил с помощью иммунофлуоресцентных методов окрашивания.

Однако, в отличие от иммунофлуоресцентного окрашивания, этот метод не требует свежих образцов крови или дорогостоящих антител. В гематологической диагностике дифференциальные лейкоциты могут служить индикаторами спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и рассматриваются в качестве раннего прогностического биомаркера рака. Демонстрацией процедуры с Абдельрахман Эльманзалави будет Кристина Насиф, технический сотрудник нашей команды в Научно-исследовательском центре медицинского устройства NRC.

Начните с тщательного смешивания 20 микролитров белковой киназы K и 400 микролитров буфера связывания лиза, содержащего магнитные бусины со свежеоттаями моноядерными клетками человеческой периферической крови в 100 микролитров PBS. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре поместите трубку на магнитную стойку в течение одной-двух минут, прежде чем удалить супернатант. С трубкой удалены из магнита, повторно приостановить ДНК бисером комплекса в 600 микролитров мыть буфера один, чтобы удалить любые не специально связанные бусы.

Поместите трубку обратно на магнит, чтобы удалить супернатант, перед мытьем клеток в 600 микролитров мыть буфера два, как только что продемонстрировали. После удаления супернатанта, дайте трубке высохнуть на магните в течение одной минуты, прежде чем добавить 100 микролитров буфера элюции в трубку с тщательным смешиванием. Затем поместите трубку на магнитную стойку на одну-две минуты, чтобы отделить магнитные бусы от ссылаемой ДНК и перенести очищенный раствор ДНК в новую трубку.

Для преобразования бисульфита очищенной ДНК перенесите 20 микролитров ссылаемого образца ДНК в трубку ПЦР и добавьте в трубку 130 микролитров реагента преобразования. После тщательного смешивания, кратко спина вниз содержимое трубки и усилить ДНК на тепловой циклер. В конце цикла добавьте 600 микролитров связывающего буфера в ионный хроматографический столбец, помещенный в коллекторную трубку, и добавьте ДНК в столбец.

Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать, и центрифугу в течение 30 секунд на полной скорости. Отбросьте собранный поток через, и добавьте 100 микролитров буфера мытья к столбецу. Центрифуга колонны и отбросить поток через снова, как попродемонстрировано.

Добавьте 200 микролитров буфера десульфонации в столбец для инкубации за 15-20 минут при комнатной температуре, прежде чем центрифугировать образец и отказаться от протекания, как это было продемонстрировано. Далее, мыть колонку два раза с 200 микролитров мыть буфера на стирку. После второй стирки перенесите колонку в новую трубку сбора 1,5 миллилитров и добавьте 100 микролитров воды класса ПЦР в мембрану колонны.

Затем, elute ДНК центрифугации столбца в течение одной минуты на полной скорости. Для генерации капель смешайте один микролитр бисульфит-преобразованной ДНК со свежеприготовленной смесью мастера зонда в трубке ПЦР и соберите образец с краткой центрифугой. Используйте пиковые фитинги для подключения одноразовых жидкостных труб до двух 250-микролитровых точных стеклянных шприцев.

И предварительно заполнить один точный стеклянный шприц с 250 микролитров несущего масла, содержащего 5%flouro surfactant, и один точный стеклянный шприц с 50 микролитров масла перевозчика. Когда оба шприца были загружены, загрузите 100 микролитров смеси ПЦР в шприц несущего масла и поместите капельное микрофлюидное устройство на сцену вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой. Для наблюдения и записи образования капель в режиме реального времени поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприц-насос, а также используйте пиковый союз с фитингами для подключения труб шприцев к трубе соответствующих входных каналов микрофлюидного устройства капли.

Поместите трубки из розетки генератора капель на внутреннюю сторону 0,5 миллилитров ПЦР трубки, и настроить скорость потока шприц насоса до двух микролитров в минуту, чтобы размер капли стабилизироваться перед сбором в результате эмульсии. Медленно и осторожно собирайте эмульсию из верхней части трубки и перенесите 75 микролитров раствора в 200 микролитровую трубку ПЦР для теплового езды на велосипеде. Затем подтвердите, что содержание масла в ПЦР-трубке близко соответствует объему рассеянной фазы, чтобы предотвратить слияние капель во время теплового цикла, и поместите 200 микролитровую трубку в тепловой циклер.

Для флуоресценции изображения эмульгированного образца, передача эмульсии ПЦР в 50-микрометровую борозиликатную капиллярную трубку с прямоугольным профилем, чтобы позволить расположение капель в тесно упакованный монослой для визуализации. После фиксации и уплотнения капилляров на слайд микроскопа загрузите слайд на стадию перевернутого микроскопа. И в микроскоп изображения программного обеспечения, выберите приобрести и жить быстро, чтобы начать в режиме реального времени приобретение камеры.

Затем наблюдайте за образцом под яркой полевой и флуоресцентной микроскопией. После генерации капель и теплового цикла капли могут быть введены в стеклянную капиллярную капиллярную систему шириной в один миллиметр и высотой 50 микрометров. Чтобы получить монослойное распределение капель, идеально подходит для получения изображения флуоресценции, изображения могут быть записаны для каждой длины волны.

После анализа изображений флуоресценция всех капель в соответствующих флюорофорах может быть установлена для установления порога положительных и отрицательных капель. После идентификации и подсчета копий значения капли могут быть рассчитаны, а процент CD3-T-клеток и CD4-25-регулятивных Т-клеток может быть определен на основе метилированных копий CD3 и FOXP3 соответственно, по отношению к копиям на каплю общей клетки или C-менее гена. Процентные значения можно сравнить с значениями, полученными с помощью иммунофлуоресценции изображений с использованием соответствующих антител.

Я думаю, что стабильность эмульсии от генерации капель через тепловой цикл и заключительные шаги по визуализации капель имеет решающее значение для получения точных, надежных и воспроизводимых результатов количественной оценки. MD PCR настройки с помощью индивидуальных ПЦР смесь формулировка может быть использована для ряда приложений, включая исследования рака, диагностики инфекционных заболеваний и аналитики на одном уровне клеток.