Обнаружение альтернативного сплайсинга Во эпителиальных-мезенхимальных перехода

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении изменений в альтернативном сплайсинге во время ЭМП. Это достигается за счет использования индуцируемой модели EMT, в которой экспрессия гибридного белка скручивается er. В эпителиальных клетках молочной железы человека клетки провоцируют проведение ЭМП после лечения тамоксифеном в качестве второго этапа.

Экспрессия изоформ сплайсинга проанализирована с помощью количественного R-T-P-C-R с использованием изоформ-специфичных наборов праймеров, что позволяет выявить альтернативные изменения сплайсинга на уровне РНК. Далее определяется обилие белка, соответствующего каждой изоформе, методом иммуноблоттинга с целью подтверждения экспрессии изоформ сплайсинга на белковом уровне, получены результаты, показывающие изменения альтернативного сплайсинга в интересующих генах во время ЭМП, на основе количественных анализов R-T-P-C-R и иммуноблоттинга, Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области альтернативного сплайсинга РН и ЭМП, например, как регулируется альтернативный сплайсинг во время ЭМП и как эта регуляция влияет на ЕМТ и патологические процессы, связанные с ЕМТ. Применение этого метода имеет отношение к терапии рака, поскольку ЭМП играет важную роль в стимулировании инвазии опухоли и метастазирования.

Тем не менее, этот метод может дать представление об альтернативном сплайсинге во время ЭМП. Метод изоформно-специфического детектирования МРА может быть применен и в других системах, таких как изучение альтернативного сплайсинга в дифференцировке нейронов и программировании гибели клеток. Первый шаг заключается в том, чтобы пластинировать клетки, экспрессирующие гибридный белок twist ER, поместить клетки в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей в двух экземплярах, затем приготовить и защитить светом раствор тамоксифена, чтобы вызвать эпителиальный мезенхимальный переход, или обработать клетки EMT 20 наномолярными средами, содержащими тамоксифен, для контрольной группы, не обработанной тамоксифеном, добавить 0,01% этанола в дополнительный набор клеток через два дня после инкубации.

Делайте снимки под световым микроскопом с 10-кратным увеличением, чтобы зафиксировать любые морфологические изменения. Далее промойте клетки холодным ПБС. Соскребите клетки с одной половины пластины в буфер для лизиса РНК для выделения РНК, а другую половину в 100 микролитры ледяного рипа-буфера для анализа белка, пропустите клетки из обеих групп, как показано ранее, и непрерывно обрабатывайте 20 наномолярными тамоксифенами или носителем.

Повторяйте эти шаги через день до 14-го дня, когда обработанные тамоксифеном скрученные клетки ER должны иметь веретенообразную мезенхимальную морфологию. В то время как органы управления, обработанные транспортным средством, должны сохранять булыжник, подобную морфологии эпителия. Здесь в качестве примера для обнаружения включения экзонов используется NNA с четырьмя экзонами.

Разработайте прямой праймер внутри переменного экзона три и обратный праймер внутри соседнего конститутивного экзона четыре. Это позволяет проводить специфическую амплификацию включенной в вариабельный экзон изоформы для специфической амплификации событий пропуска экзонов. Проектируйте грунтовки, охватывающие стык образующего экзона 2 и 4, которые в противном случае были бы разрушены при включении переменного экзона три.

Спроектируйте другой праймер внутри четвертого конститутивного экзона, чтобы обнаружить общие транскрипты гена и избежать продуктов ПЦР, амплифицированных из геномной ДНК или прем-NA.Design праймеров в двух конститутивных экзонах, когда они будут готовы. Следует стандартным процедурам экстракции РНК для выделения РНК из образцов клеток, собранных ранее. Определить концентрацию и качество РНК путем абсорбции УФ-излучения для синтеза первой цепи CD NA настроили реакции обратной транскриптазы в конечном объеме 20 мкл.

Проводите реакции RT при температуре 42 градуса Цельсия в течение одного часа, а затем инкубацию при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут. Для инактивации фермента RT в режиме реального времени. ПЦР установила 20 микролитровых реакций, которые состоят из 10 микролитров киберзеленой мастер-смеси, от 0,1 до 1,0 микролитров матрицы CD NA и пяти пикомольных прямых и обратных праймеров.

Проводите ПЦР в реальном времени с 40 циклами в трех экземплярах. Проверьте кривые диссоциации и убедитесь, что для каждого набора грунтовок наблюдается один пик. Получение значений цикла количественной оценки путем вычисления значений второй производной кривых усиления.

Рассчитайте относительное количество мРНК-мишеней в индуцированных образцах по сравнению с неиндуцированным образцом с использованием метода дельта-дельта CQ, как показано в этой формуле. Оставьте собранные для анализа белка клетки на льду примерно на 10 минут перед центрифугированием и сбором надосадочной жидкости. После определения концентрации белка разбавьте образцы в загрузке SDS, буферизуйте и загрузите от 20 до 40 мкг белков в 10%-ные гели SDS.

Запустите SDS page gels при 20 миллиамперах в течение 1,5 часов. По истечении этого времени перенесите белки на мембраны PVDF во влажной системе переноса при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов при напряжении 85 вольт. Отрегулируйте время переноса в соответствии с молекулярной массой целевых белков.

Затем закройте мембрану в 5% обезжиренном молоке на срок от 30 минут до одного часа. При комнатной температуре инкубируйте мембрану с первичным антителом при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Первичное антитело распознает эпитоп в области покрытия конститутивного экзона и одновременно обнаруживает сликовые изоформы на основе их различных размеров белков.

В то же время контролируйте ЭМП с помощью иммуноблоттинга. Для маркеров EMT. Используйте eec, ahern, гамма-катенин и окклюдин в качестве эпителиальных маркеров, а фибронектин n, кадгерин и ментон - в качестве мезенхимальных маркеров.

На следующий день промойте мембрану трижды с TBST с интервалом в пять минут. Затем инкубируют мембрану с конъюгированным HRP вторичным антителом в разведении от одного до 10 000 в течение одного часа при комнатной температуре. По истечении этого времени промойте мембрану три раза с TBST с интервалом в пять минут.

Наконец, визуализируйте белки с помощью системы обнаружения хемилюминесценции и подвергните мембрану воздействию авторадиографической пленки. Индуцированная твистом ЭМП характеризовалась переходом от булыжного эпителиального фенотипа к удлиненному фибробластическому фенотипу, демонстрирующему отсутствие эпителиальных маркеров, е-кадгерина, гамма-катенина и окклюдина, а также повышение регуляции мезенхимальных маркеров, фибронектина и кадгерина и виментина. Кроме того, ЭМП оценивали по потере локализации ЭК-кадгерина в изображенных клеточных соединениях.

Ниже приведены конструкции праймеров для детектирования изоформ сплайсинга CD 44. Места расположения грунтовки обозначены разноцветными стрелками. Результаты анализов Q-R-T-P-C-R указывают на значительное снижение мРНК CD 44 V и увеличение мРНК CD 44 s после 14 дней лечения TAM.

Напротив, общий транскрипт CD 44 оставался неизменным во время ЭМП, что соответствовало результатам Q-R-T-P-C-R, уровень белка CD 44 V заметно снизился, в то время как экспрессия белка CD 44 s была значительно повышена во время этой процедуры. Важно помнить, что успешная индукция ЛОР имеет решающее значение. Таким образом, ЛОР должен быть тщательно подтвержден различными методами, такими как обнаружение изменений в клеточной морфологии, экспрессия ЛОР-маркеров и локализация RIN на поверхности клетки.

В соответствии с этой процедурой могут быть выполнены другие методы, такие как анализ управления сплайсингом, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: как эти действующие элементы и факторы влияют на регуляцию альтернативного сплайсинга после его разработки? Этот метод проложил путь исследователям в области биологии РНК, биологии развития и биологии рака к изучению альтернативной регуляции сплайсинга в процессах EMT во время нормального развития и метастазирования рака.