Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области альтернативного сплайсинга пре-мРНК. В частности, он обеспечивает надежную, чувствительную систему анализа для изучения альтернативных схем сплайсинга in situ в срезах тканей. С помощью этого метода можно анализировать альтернативный сплайсинг одновременно во многих подтипах, которые содержатся в сложных биологических структурах, таких как мозг мыши.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что в ней используются ударные антистатические зонды экзонного перехода в гибридизации мРНК in situ для получения специфических сигналов гибридизации. Технология усиления сигнала в здании повышает чувствительность детектирования для получения надежных сигналов гибридизации. Обнаруженные сигналы были экзонными включениями, ускользающими от конкретных зондов, которые используются для расчета процента сплайсинга в жизненно важных органах в различных анатомических областях мозга мыши.

В данном исследовании экзон NF1 23a используется в качестве примера для иллюстрации использования системы анализа. Тем не менее, система может быть адаптирована для анализа паттернов экспрессии многих альтернативных экзонов. Чтобы начать парафинизацию участка D мозга мыши, заполните две мытьевые посуды 250 миллилитрами ксилола.

И еще два с 250 миллилитрами 100% этанола внутри вытяжного шкафа. Вставьте салфетки в решетку для стирки. Затем поместите решетку для мытья в чашку, содержащую ксилол, и инкубируйте в течение пяти минут, перемещая решетку вверх и вниз не менее трех раз, и повторите то же самое со второй чашкой с ксилолом.

Затем поместите решетку в чашку, содержащую этанол, и выдерживайте в течение двух минут, повторяя те же движения вверх и вниз, а затем повторите то же самое со второй чашкой для этанола. Чтобы высушить предметные стекла, переместите решетку со второй чашки для этанола и поместите ее внутрь инкубатора при температуре 60 градусов Цельсия на пять минут. С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте барьер размером 0,75 на 0,75 дюйма вокруг участка ткани и высушите на воздухе в течение трех минут при комнатной температуре.

Включите печь для гибридизации и установите температуру на уровне 40 градусов по Цельсию. После полного смачивания увлажняющей бумаги дистиллированной водой поместите ее в лоток для контроля влажности. Затем вставьте противень для контроля влажности в печь для гибридизации.

После размещения высушенных слайдов на скамейке полностью покройте участки тканей на каждом слайде пятью-восемью каплями раствора перекиси водорода. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Постучите по слайдам на впитывающей бумаге, по одному, чтобы удалить раствор перекиси водорода, и вставьте слайды в решетку для стирки.

Погрузите решетку в посуду для мытья с водой, перемещая ее вверх и вниз от трех до пяти раз, чтобы вымыть горки. Наполните литровый стеклянный стакан, помещенный на горячую плиту, 700 миллилитрами 1X для удаления мишени и накройте его фольгой. Вставьте термометр через крышку из фольги и включите конфорку, поставив на высокую температуру на 10 – 15 минут.

Как только температура реагента достигнет 98 градусов по Цельсию, установите горячую пластину на низкую температуру, чтобы поддерживать слабое кипение. Далее аккуратно снимите фольгу и поместите решетку внутрь стакана. Накройте стакан фольгой и выдерживайте 15 минут.

С помощью щипцов перенесите стойку из стакана в посуду для мытья, содержащую 200 миллилитров дистиллированной воды, и выдержите в течение 15 секунд. Через 15 секунд поместите решетку в посуду для мытья, содержащую 100% этанол, и выдержите в течение трех минут. Снимите решетку с посуды и сушите при температуре 60 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Поместив предметные стекла на решетку для пятен, накройте срезы ткани пятью каплями протеазы 3 на предметное стекло. Осторожно поместите решетку в лоток для контроля влажности, вставьте его в печь для гибридизации и инкубируйте при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут. Сняв решетку с лотка, постучите по предметным стеклам, чтобы удалить лишнюю жидкость, и вставьте их в решетку для стирки.

Поместите решетку в миску с дистиллированной водой и переместите решетку вверх и вниз от трех до пяти раз, чтобы вымыть слайды. Чтобы подготовиться к гибридизации in situ, инкубируйте зонды и реагенты АМФ при комнатной температуре в течение 30 минут. Вставьте противень для контроля влажности в печь для гибридизации и установите температуру 40 градусов Цельсия.

Для гибридизации зондов снимите предметные стекла с моечной решетки и постучайте по ним, чтобы удалить лишнюю жидкость. Поместите слайды на решетку для пятен. С помощью карандаша подпишите слайды именем щупа.

Поместите три смежных предметных стекла мозговой ткани для гибридизации с тремя различными зондами митоза нервных волокон первого типа. Поскольку существуют очень разные изоформно-специфичные зонды, я использую соседние разрезанные срезы ткани. Крайне важно, чтобы эти участки обрабатывались одинаково на этапах гибридизации, усиления и детектирования сигнала, чтобы обеспечить точность процентного сращивания при расчете.

Накройте срезы тканей четырьмя каплями зонда на срез, по одному предметному стеклу за раз, чтобы предотвратить высыхание срезов. Затем поместите решетку для пятен в лоток для контроля влажности и поставьте ее в духовку с температурой 40 градусов Цельсия на два часа. Затем поместите решетку для мытья в посуду для мытья, наполненную 200 миллилитрами буфера для стирки 1X.

Затем нажимайте на каждый слайд, по одному на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. И сразу вставляем каждую горку в решетку для стирки. Выдерживайте при комнатной температуре в течение двух минут в посуде, наполненной буфером для свежей стирки, перемещая решетку вверх и вниз от трех до пяти раз, а затем повторите стирку в новой посуде.

Для усиления сигнала коснитесь каждого слайда, чтобы удалить излишки буфера для стирки, и поместите их на решетку для пятен. Покройте участок ткани на каждом предметном стекле четырьмя каплями реагента AMP zero. Затем поместите решетку в лоток для контроля влажности, вставьте противень в духовку и выдерживайте при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Дважды промойте предметное стекло буфером для промывки, как это было сделано ранее в этом эксперименте. Повторите этап усиления сигнала с реагентами АМФ от одного до шести, как описано в текстовом протоколе, и промойте предметные стекла после каждого шага. Для обнаружения сигнала удалите излишки буфера для стирки со стекол, постучав по ним, и поместите их на решетку для пятен.

Затем смешайте два микролитра быстрого красного В со 120 микролитрами быстрого красного А в микроцентрифужной пробирке. Добавляйте раствор в срезы ткани на каждом предметном стекле, чтобы полностью покрыть их. Поместите решетку для пятен в лоток для контроля влажности, накройте лоток крышкой и выдерживайте в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем достаньте раствор и вставьте предметные стекла в решетку для мытья. Поместите решетку в посуду для мытья с водой из-под крана, чтобы вымыть горки и повторить стирку. После второй стирки постучите по впитывающей бумаге, чтобы удалить лишнюю воду.

Далее поместите решетку в посуду с 50% раствором для окрашивания гематоксилина. Переместите решетку вверх и вниз несколько раз. И выдерживать две минуты при комнатной температуре.

Переложите решетку в посуду для мытья головы с водой из-под крана. Переместите решетку вверх и вниз пять раз и повторяйте стирку, пока горки не станут прозрачными, а срезы ткани останутся фиолетовыми. Затем переложите решетку в тарелку, содержащую 0,02% аммиачной воды.

Перемещайте решетку вверх и вниз два-четыре раза, пока секции не станут синими. Промойте горки водой из-под крана от трех до пяти раз в посуде для окрашивания. Затем поместите решетку внутрь инкубатора и инкубируйте в течение 15 минут при температуре 60 градусов Цельсия, чтобы высушить предметные стекла.

Когда полностью высохнет, добавьте по одной капле монтажного средства на каждое предметное стекло, чтобы покрыть срез. Затем осторожно наденьте покровный лист размером 24 на 50 миллиметров на срезы ткани на каждом предметном стекле. После сушки предметных стекол на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре приступайте к сбору данных.

Чтобы рассчитать процент сплайсинга или значение PSI для экзона 23a, подсчитывают количество клеток и точек в трех субобластях коры и гиппокампа CA3. Анализ гибридизации РНК in situ проводится в срезах мозга мышей дикого типа CD1 с использованием трех различных зондов, специфичных для NF1. Красные точечные точки, наблюдаемые в отделах коры и гиппокампа, указывают на положительные сигналы по общему количеству NF1, специфичным включениям и пропуску специфических зондов.

Затем подсчитываются сигналы ISH от трех зондов и используются для вычисления PSI. Анализ гибридизации РНК in situ проводится в коре черных мышей дикого типа C57 6J и черных мышей C57 с мутантным типом 6J, в которых экзон 23a включен во все типы клеток. Красные точечные точки, наблюдаемые в коре головного мозга черных мышей дикого типа C57 6J, указывают на положительные сигналы по общему количеству NF1, специфичным включениям и пропуску специфических зондов.

У черных мутантных мышей C57 6J аналогичные сигналы получаются с помощью зондов NF1 total и inclusion специфичных. Однако при использовании пропуска определенного зонда сигнал не обнаруживается, что указывает на то, что два зонда, нацеленные на включение или пропуск экзона, являются высокоспецифичными. Поскольку многоцветная маркировка на одних и тех же предметных стеклах тканей пока недоступна для этой процедуры, на разных предметных стеклах используются разные датчики.

Чтобы получить точные значения процентного сращивания, важно использовать смежные срезы и обрабатывать предметные стекла одним и тем же образом на протяжении всей этой процедуры. Дополняют эту процедуру такие мероприятия, как иммуногистохимия, которые могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы, касающиеся локализации и функции дифференциально экспрессируемых изоформ сплайсинга.