Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать дышащие митохондрии из культивируемых клеток или тканей мыши, а затем оценить силу их мембранного потенциала в качестве меры клеточного статуса. Для культивируемых клеток это достигается путем сначала покрытия, а затем обработки клеток. Затем клетки гомогенизируются и гомогенат пропускается через иглу для дальнейшего высвобождения митохондрий из клеток.

Для мышиной ткани печень вырезается из мыши, а затем гомогенизируется на льду с обоими типами исходного материала. Затем дифференциальное центрифугирование используется для выделения митохондрий из остального клеточного содержимого. После того, как митохондрии подвергаются некоторой обработке, включая добавление чувствительного к мембранному потенциалу флуоресцентного красителя, проводятся флуоресцентные измерения TMRE для расчета силы мембранного потенциала.

В конечном счете, функция митохондрий и возмущения в потенциале митохондриальной мембраны могут быть оценены с помощью чувствительного к мембранному потенциалу флуоресцентного красителя в сочетании с флуоресцентным считывателем пластин. Хотя этот метод может дать представление о цитокин-индуцированном апоптозе и дисфункции митохондрий в LS.It также может быть применен к любой другой системе, где сравниваются два или более различных образца искомых, таких как здоровый против болезни или двух разных видов животных с разной скоростью метаболизма. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Поскольку митохондрии изолируют их, этапы изоляции трудно освоить.

Это связано с тем, что при выполнении техники существует множество нюансов, которые можно не заметить в разделах традиционных методов. Начните эту процедуру с выращивания эмбриональных клеток почки человека, как описано в текстовом протоколе, за 48 часов до обработки цитокином планшетом, 160 000 клеток в колбу T 1 75 для получения около 70% плотности на момент лечения. Затем сыворотку голодают клетки через 24 часа, отсасывая среду и заменяя ее тем же объемом свободной сыворотки.

Наконец, обработайте клетки, испытывающие сывороточный голод, путем добавления солюбилизированных цитокинов непосредственно в питательную среду для выделения митохондрий. Сначала аспирируйте среду и дважды промойте адгезивные клетки 15 миллилитрами одного х фосфатно-солевого буфера или PBS. Каждый раз после промывки отсасывайте буфер и соскребите колбу, чтобы удалить прилипшие клетки со дна.

Затем добавьте по 15 миллилитров по одному XPBS в каждую колбу, перемешайте и переложите в отдельные 15-миллилитровые конические трубки на лед. После завершения соскабливания центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при температуре 700 G четыре градуса Цельсия, используя настольную центрифугу с качающимся ротором ведра после центрифугирования, аспирации надосадочной жидкости и реанимации. Суспендируйте каждую гранулу в одном миллилитре митохондриального изоляционного буфера.

Далее соедините обе суспензии и переложите в небольшой стеклянный сосуд для гомогенизации в митохондрии ресуспендию и буфер для изоляции митохондрий в стеклянный сосуд до тех пор, пока раствор не достигнет первой линии. Следует соблюдать осторожность при помещении пестика в раствор для удаления пузырьков воздуха, не поднимать пестик над жидкостью и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами. Перелейте гомогенизированный раствор в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Затем наберите раствор в трехмиллилитровый шприц с помощью иглы 18 калибра, один на полдюйма, и вытолкните его обратно в коническую трубку на льду с помощью иглы 27 калибра в полдюйма. Следите за тем, чтобы раствор выталкивался о внутреннюю стенку пробирки, чтобы использовать эту силу для разрушения клеточной мембраны. Повторите действия шприца в общей сложности пять раз, затем перелейте раствор в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте в течение пяти минут при температуре 600 раз G четыре градуса Цельсия в настольной центрифуге с помощью качающегося ротора ведра.

Митохондрии находятся в надосадочной жидкости после этого первого низкоскоростного спина, в то время как некоторые мембраны и неповрежденные клетки обрабатываются, тщательно удаляются надосадочная жидкость и распределяются по трем 1,5-миллилитровым трубкам. Затем центрифугируйте три пробирки в роторе с фиксированным углом наклона при температуре 10 000 G четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Митохондрии из культивируемых клеток имеют беловатый цвет.

Удалите печень у каждого животного и поместите ледяную охладительную жидкость без кальция или магния, чтобы смыть кровь. Переложите ткань печени в гостевую посуду на льду и нарежьте ее на мелкие кусочки с помощью свежего лезвия бритвы в течение одной минуты. Далее добавьте в сосуд ткань и соответствующий буфер до тех пор, пока буфер не дойдет до первой линии.

Приступайте к гомогенизации ткани на льду с помощью ручного пестика в течение пяти проходов. Следует соблюдать осторожность при помещении пестика в раствор для удаления пузырьков воздуха, не поднимать пестик над жидкостью и использовать постоянную скорость с непрерывными проходами. Продолжайте обработку образцов центрифугированием и гомогенизацией, как указано в текстовом протоколе.

После объединения новых надосадочных жидкостей с первой надосадочной жидкостью из каждого образца центрифугируйте пробирки в роторе с фиксированным углом наклона при температуре 10 000 раз G четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Осторожно отсасывайте верхний белый пушистый слой с помощью кончика пипетки и/или отодвигая его к боковым сторонам трубки. Затем аккуратно слейте остатки надосадочной жидкости и восстановите.

Суспендировать гранулы митохондрий печени в 500 микролитрах митохондриального выделения. Буферные митохондрии печени коричневого цвета. Быстро поместите образцы на лед непосредственно перед началом реакции.

Разбавляют митохондрии до 0,5 миллиграмм на миллилитр. Рабочая концентрация с экспериментальным буфером. Добавьте соответствующие методы лечения, как указано в текстовом протоколе, в отдельные пробирки на одну 10-ю от общего объема разбавленных митохондрий.

Затем поместите разбавленные митохондрии в каждую реакционную пробирку и осторожно перемешайте каждую пробирку, чтобы обеспечить правильное перемешивание. Инкубируйте реакции на столе в течение семи минут. Затем добавьте равный объем двух микромолярных тетраэтилов, палочку домина, этиловый эфир, сокращенно ТМРЭ к митохондриальному реакционному объему.

Опять же, осторожно перемешивая каждую трубку, чтобы обеспечить правильное перемешивание. После инкубации реакций на столе в течение дополнительных семи минут гранулируйте митохондрии центрифугированием в роторе с фиксированным углом наклона при температуре 10 000 раз G четыре градуса Цельсия в течение пяти минут. Затем загрузите половину надосадочной жидкости каждого образца на 3 84.

Скважинный планшет приступает к считыванию флуоресценции образцов, а затем рассчитывает кратную разницу флуоресценции между контролем и каждым лечением, как описано в текстовом протоколе: лечение HEK 2, 93 Т-клеток с TNF, альфа, IL, одним бета и ИФН гамма в течение 24-48 часов, приводит к прогрессирующей клеточной гибели. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализов МТТ, которые последовательно демонстрируют, что при 24-часовом лечении жизнеспособность клеток снижается примерно на 10%, а при 20-часовом лечении – на 20%. При 48-часовой обработке клетки, обработанные одинаковыми концентрациями, дают аналогичные результаты гибели клеток через 48 часов.

А лечение отдельными цитокинами показывает, что снижение жизнеспособности обусловлено комбинаторными эффектами. Данные о жизнеспособности представляют собой среднее стандартное отклонение трех отдельных экспериментов. Каждый прогон в трех экземплярах и плотность полос погрешностей демонстрируют воспроизводимость данных.

Процентное снижение мембранного потенциала в митохондриях, выделенных из клеток, обработанных цитокинами, означает, что лечение цитокинами повлияло на здоровье митохондрий, что подтверждает данные о жизнеспособности после этой процедуры. Другие методы, такие как оценка генерации ТП, общего ТП или потребления кислорода, могут быть сформированы для того, чтобы оценить дополнительные вопросы, например, какие различия в энергии и дыхании между различными образцами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать неповрежденные функциональные митохондрии и оценить силу их мембранного потенциала как отражения клеточного статуса.