Субклонирование Плюс погружения (SPI) - Роман Recombineering способом быстрого строительства генного таргетинга векторы

Общая цель данного эксперимента заключается в создании векторов-нацелен на гены с использованием субклонирования и вставки. Это достигается за счет трансформации спины, содержащей кишечную палочку, с рекомбинирующей плазмидой. Второй этап включает в себя создание асимметричных фосфоросодержащих вставных кассет и субклонирование плазмид методом полимеразной цепной реакции.

После добавления арабинозы рекомбинирующие белки GBAA экспрессируются, а концевая модифицированная вставочная кассета и плазмида субклонирования подвергаются электропоре. Желаемая последовательность ДНК одновременно захватывается с обратной стороны и модифицируется с помощью вставной кассеты в плазмиду субклонирования. Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как стандартная рекомбинация, заключается в том, что построение вектора нацеливания на гены может быть выполнено за одну реакцию.

Для начала проектирования олигогенов для вставочной кассеты и субклонирующей плазмиды спроектируйте каждый олиго таким образом, чтобы он содержал 180 гомологических плеч по бокам геномной мишени, и 20 пар оснований специфическую последовательность прайминга для вставочной кассеты или субклонирующей плазмиды. Затем определите ориентацию геномной вставки ДНК заднего клона с помощью веб-инструмента, такого как clone db. Определите направление репликации от или ЭС, проверив карту заднего плазмидного каркаса, используемого в задней части тела.

Библиотечная конструкция, добавляем две концевые фосфофонные восемь связей, таким образом, пять основных концов олиго, которые находятся напротив направления репликации на обратном клоне. Затем добавьте модификацию с пятью основными фосфатами в обратный олигопласт. Сначала вбейте стерильный наконечник пипетки в культуру заднего агара и закиньте 5,0 миллилитров одинового бульона.

Выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти часов с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. Далее охладите, 10% раствор глицерина, микроцентрифугу, пробирки и электропорацию, кюветы на охладителе льда, охлаждаемую большую центрифугу и микроцентрифугу до четырех градусов Цельсия. После инкубации определяют оптическую плотность культуры с помощью спектрофотометра.

Измерение поглощения. На 600 нанометрах. Подготавливайте электрокомпетентные ячейки при достижении значения наружного диаметра 600 от 0,3 до 0,8.

Когда культура будет готова, раскрутите клетки вниз в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров. Промойте клетки одним миллилитром охлажденного 10%-го глицерина и снова отверните. Выполните эти действия промывки в общей сложности три раза.

Ресуспендируйте клетки в общем объеме 50 микролитров и добавьте от 10 до 200 нанограммов рекомбинирующей плазмиды. Получите суспензию для одной клетки путем пипетирования вверх и вниз несколько раз, а затем перенесите клетки на электропорацию предварительного охлаждения. Вете. Затем поместите вете в устройство для электропорации и немедленно включите электропривод клеток, восстановите клетки в одном миллилитре LB и перенесите элементы в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров.

Выращивайте заднюю культуру при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух часов с встряхиванием при 200 об/мин. По истечении этого времени добавьте в восстановленную культуру девять миллилитров LB. Выращивайте в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин, чтобы встроить гомологические плечи в кассету для введения и плазмиду для клонирования субкана.

Проводят ПЦР с использованием долго модифицированных олигонок, приготовленных ранее. В качестве альтернативы можно линеаризировать плазмидный шаблон Используя фермент рестрикции, выберите тот, который разрезает за пределами области амплификации ПЦР и нагревается в активированном состоянии. Настройте ПЦР с помощью высокоточной системы ДНК-полимеразы с высоким коэффициентом горячего запуска.

Приготовьте мастер-смесь для ПЦР и выполните термоциклирование в соответствии с передовыми методами. После реакции проанализируйте продукты ПЦР методом гель-электрофореза AROS. Загрузите от одного до пяти микролитров каждого ПЦР в 1%-ный гель.

Далее очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР. Количественно оценивайте ДНК, амплифицированную методом ПЦР, в соответствии с известным набором стандартов ДНК или с помощью спектрофотометра NanoDrop. После ночной инкубации разведите заднюю культуру GBAA в 50 раз и подготовьте отдельную культуру для отрицательного контроля.

Разведенные культуры выращивают при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин в течение одного часа 50 минут. Затем охладите все рекомбинирующие материалы и оборудование до четырех градусов Цельсия, как было показано ранее. Приготовьте 10% веса на объем раствора OSE и простерилизуйте фильтр через шприц-фильтр 0,2 мкм.

Когда внешний диаметр бэк-культуры достигнет желаемого уровня, приступайте к индуцированию рекомбинирующих белков. Добавьте 200 микролитров 10%-ного арабского раствора к 10 миллилитрам задней культуры для достижения конечной концентрации аоса 0,2%Включите неиндуцированную культуру для использования в качестве отрицательного контроля. Перенесите культуры в инкубатор с встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия и вызывайте красное сцеживание в течение 45 минут с встряхиванием со скоростью 230 об/мин.

Уменьшите количество клеток и промойте их 10% глицерином три раза, как показано ранее, при концентрации от 600 до 1000 нанограммов. Каждая из вставных кассет и субклонирующая плазмида для рекомбинации включают в себя управление только вектором и вектором плюс одна вставка для проверки рекомбинационного мастерства и целостности вектора. Затем получите суспензию для одного элемента и приведите элементы в действие электроприводом, как показано ранее.

Обеспечьте восстановление в среде LB при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа для плазмид с несколькими копиями или в 10 фунтах при 37 градусах Цельсия в течение трех часов для обратных векторов. Проводите различные разведения с полученной культурой на основе двойного отбора. Агар радуют и выращивают при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов.

Когда все будет готово, соберите колонии на пять миллилитров LB, содержащих селективный антибиотик, и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем с помощью набора для очистки колонок получите мини-препверсию ДНК, введите соответствующий фермент рестрикции, а затем определите клоны, содержащие ожидаемые размеры фрагментов, с помощью гель-электрофореза. Наконец, выполните секвенирование ДНК через плечи гомологии и вставную кассету для проверки на наличие ошибок фотосинтеза оли.

В этом примере анализ рестрикционного разложения P двух RX и одной вставки EYFP, содержащих клоны, показал ожидаемую закономерность, указывающую на то, что они содержат правильно собранный вектор детонации. Эта схема иллюстрирует концепцию обрезки bact. Использование субклонирования и анализа вставок продуктов ПЦР подтвердило правильность встраивания кассет.

Кроме того, при анализе положительных спинных клонов после добавления соответствующего фермента рестрикции была получена ожидаемая картина. Анализ рестрикционного расщепления 12 указанных клонов R SR двух SBI показал правильную сборку вектора у большинства рекомбинантов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как быстро конструировать векторы, нацеленные на гены, с помощью субклонирования и вставки.