Челночное клонирование на основе CRISPR: высокопроизводительный метод клонирования
13 июня 2025 г.
Мы описываем протокол для высокопроизводительного метода клонирования, челночного клонирования на основе CRISPR (CRISPRshuttle cloning), который позволяет переносить интересующие фрагменты ДНК между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК.
Мы описываем наш протокол для метода клонирования с высокой пропускной способностью, CRISPRshuttle. Что предполагает перенос фрагментов ДНК-мишени между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК. Существующие методы, такие как шлюзовая инфузия и одновекторная клонирование ПЦР-амплификации. Этот подход требует процедур, специфичных для фрагментов, включая первичный дизайн и валидацию секреции. Эти метки являются трудоемкими и занимают много времени. Челнок CRISPR исключает ПЦР при переносе фрагментов целевой ДНК между векторами в последовательные реакции в пробирке. Этот метод устраняет необходимость в работе с конкретными фрагментами и, таким образом, ускоряет изготовление образцов.
[Рассказчик] Для начала приготовьте мастер-смесь для заданного числа реакций пищеварения, комбинируя реагенты, показанные на экране. Разложите правильно промаркированные трубки объемом 0,2 миллилитра в алюминиевом охлаждающем блоке на льду. Приготовьте мастер-смесь для N числа реакций, смешав соответствующие количества буфера CAS9 sgRNA 10 CAS9 и воду, обработанную DEPC. Тщательно перемешайте мастер-микс и раскрутите его. Внесите 3,75 микролитра исходной смеси в каждую реакционную пробирку. Добавьте 0,75 микролитра 0,03 микромолярной плазмиды PLX 304 ORF в каждую тщательно перемешанную пробирку и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Приготовьте мастер-микс, соединив 0,14 микролитра 3,36 микромолярного линеаризова pBIDC-UASC-pLXvect и 1,8 микролитра сборочной мастер-смеси Gibson. Тщательно перемешайте мастер-микс и раскрутите его. Теперь смешайте по 1,94 микролитра мастера в каждую трубочку. Добавьте в каждую пробирку по 1,66 микролитра расщепленной плазмиды CAS9. Тщательно перемешайте и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия в течение часа. Разморозьте бактериальные компетентные клетки на льду. Внесите 10 микролитров размороженных клеток в каждую предварительно охлажденную 1,5 миллилитровую пробирку. Аккуратно смешайте 10 микролитров компетентных клеток с одним микролитром сборочного продукта Gibson. Поместите трубочки на лед на 30 минут. Подвергните трубки тепловым ударом при температуре 42 градуса Цельсия в течение одной минуты, а затем охладите на льду в течение двух минут. Добавьте 100 микролитров предварительно подогретой среды SOC в каждую пробирку и встряхивайте при 250 об/мин в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, поместите клетки на агаровые пластины LB, содержащие 15 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола, и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На этом рисунке представлены репрезентативные результаты рестрикционного анализа плазмид UAS-кДНК/ORF, полученных с помощью системы CRISPRshuttle. В этом анализе рестрикционное расщепление 15 конструкций UAS-кДНК/ORF с PVU2 показало, что все образцы демонстрируют ожидаемые паттерны фрагментов примерно на 1072 парах оснований и 1820 парах оснований.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол метода высокопроизводительного клонирования, известного как шаттл-клонирование на основе CRISPR (CRISPR-шаттл-клонирование). Эта инновационная методика облегчает перенос фрагментов ДНК между векторами без необходимости в ПЦР-амплификации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная инженерия
- Молекулярная биология
- Технология CRISPR
Теоретические основы
- Традиционные методы клонирования часто требуют ПЦР-амплификации.
- Технология CRISPR произвела революцию в генетических манипуляциях.
- Высокопроизводительные методы имеют важное значение для крупномасштабных исследований.
- Эффективный перенос вектора имеет решающее значение для различных областей применения.
Цель исследования
- Представить новый метод клонирования.
- Оптимизировать процесс переноса фрагментов ДНК.
- Устранить необходимость использования ПЦР в процедурах клонирования.
Используемые методы
- Разработка протокола клонирования CRISPRshuttle.
- Оценка эффективности переноса ДНК.
- Сравнение с традиционными методами клонирования.
- Применение метода в различных векторных системах.
Основные результаты
- Успешный перенос фрагментов ДНК между векторами.
- Значительное сокращение времени и ресурсов по сравнению с методами ПЦР.
- Высокая эффективность, продемонстрированная в ходе многочисленных тестов.
- Потенциал для широкого применения в генетических исследованиях.
Выводы
- Клонирование с помощью CRISPRshuttle является жизнеспособной альтернативой традиционным методам.
- Данный метод повышает эффективность генной инженерии.
- Будущие исследования могут использовать эту методику для проведения сложных генетических манипуляций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительное создание общегеномных библиотек плазмид является важнейшим инструментом для систематического изучения функций генов и валидации мишеней в биофармацевтических исследованиях и разработках. Шаттл-клонирование на основе CRISPR (CRISPRshuttle) исключает необходимость ПЦР-амплификации, упрощая перенос фрагментов ДНК между векторами и ускоряя создание библиотек. Эта возможность повышает точность прогнозов и операционную эффективность на ключевых этапах поиска новых терапевтических средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает быструю сборку плазмидных библиотек геномного масштаба для функционального геномного скрининга.
- Поддерживает систематическое исследование функций генов в различных биологических путях.
- Способствует биологическому снижению рисков и надежной валидации мишеней за счет высокопроизводительного создания конструктов.
- Повышает прогностическую уверенность при последующем выборе и сортировке мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные плазмидные конструкции для масштабируемых рабочих процессов скрининга без появления артефактов последовательности, вызванных ПЦР.
- Стандартизирует результаты клонирования, что способствует воспроизводимости и разработке количественных методов анализа.
- Ускоряет подготовку к высокопроизводительной оценке соединений и использованию платформ для фенотипического скрининга.
- Обеспечивает эффективное повторное использование ресурсов донорских плазмид в различных форматах анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Оптимизирует создание генетических конструкций, имеющих отношение к заболеванию, для разработки доклинических моделей.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет возможности быстрой итерации конструкций.
- Устраняет технические препятствия в трансляционных исследованиях биомаркеров и механизмов развития заболеваний.
- Повышает точность принятия решений о дальнейшем продвижении разработок с учетом рисков, предоставляя надежные генетические инструменты.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Клонирование с помощью CRISPRshuttle интегрируется на стыке этапов предварительных исследований и идентификации перспективных соединений, обеспечивая плавный переход от выбора генов на основе гипотез к высокопроизводительному созданию и скринингу конструктов.
- Биология открытий: ускоряет проверку гипотез и картирование путей за счет обеспечения быстрого масштабируемого клонирования генных мишеней.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных конструктов без использования ПЦР для воспроизводимой разработки анализов и проведения кампаний по скринингу.
- Аналитика: предоставляет количественные данные об эффективности клонирования и целостности конструктов, поддерживая принятие решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: облегчает создание конструктов для моделей, релевантных заболеваниям, и исследований биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую высокопроизводительную платформу клонирования для текущих потребностей портфеля разработок.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях функций генов.
- Операционная ценность: обеспечивает высокую эффективность (>94%) и масштабируемость, что позволяет небольшим группам быстро создавать библиотеки.
- Стратегическая ценность: улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет ускорения получения конструктов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков, а также продвижение валидированных мишеней и методов анализа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами расщепления с помощью CRISPR/Cas9 и сборкой по Гибсону.
- Необходим доступ к совместимым донорским плазмидам и векторам, готовым к использованию в системе CRISPRshuttle.
- Требуются стандартизированные протоколы для обеспечения воспроизводимости данных между группами исследователей и целостности данных.
- Может потребоваться адаптация для различных векторных остовов или систем, специфичных для конкретных организмов.
- Эффективность и пропускная способность зависят от качества реагентов и оптимизации рабочего процесса.
