Челночное клонирование на основе CRISPR: высокопроизводительный метод клонирования
June 13th, 2025
Мы описываем протокол для высокопроизводительного метода клонирования, челночного клонирования на основе CRISPR (CRISPRshuttle cloning), который позволяет переносить интересующие фрагменты ДНК между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК.
Мы описываем наш протокол для метода клонирования с высокой пропускной способностью, CRISPRshuttle. Что предполагает перенос фрагментов ДНК-мишени между векторами без необходимости ПЦР-амплификации фрагментов ДНК. Существующие методы, такие как шлюзовая инфузия и одновекторная клонирование ПЦР-амплификации. Этот подход требует процедур, специфичных для фрагментов, включая первичный дизайн и валидацию секреции. Эти метки являются трудоемкими и занимают много времени. Челнок CRISPR исключает ПЦР при переносе фрагментов целевой ДНК между векторами в последовательные реакции в пробирке. Этот метод устраняет необходимость в работе с конкретными фрагментами и, таким образом, ускоряет изготовление образцов.
[Рассказчик] Для начала приготовьте мастер-смесь для заданного числа реакций пищеварения, комбинируя реагенты, показанные на экране. Разложите правильно промаркированные трубки объемом 0,2 миллилитра в алюминиевом охлаждающем блоке на льду. Приготовьте мастер-смесь для N числа реакций, смешав соответствующие количества буфера CAS9 sgRNA 10 CAS9 и воду, обработанную DEPC. Тщательно перемешайте мастер-микс и раскрутите его. Внесите 3,75 микролитра исходной смеси в каждую реакционную пробирку. Добавьте 0,75 микролитра 0,03 микромолярной плазмиды PLX 304 ORF в каждую тщательно перемешанную пробирку и инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Приготовьте мастер-микс, соединив 0,14 микролитра 3,36 микромолярного линеаризова pBIDC-UASC-pLXvect и 1,8 микролитра сборочной мастер-смеси Gibson. Тщательно перемешайте мастер-микс и раскрутите его. Теперь смешайте по 1,94 микролитра мастера в каждую трубочку. Добавьте в каждую пробирку по 1,66 микролитра расщепленной плазмиды CAS9. Тщательно перемешайте и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия в течение часа. Разморозьте бактериальные компетентные клетки на льду. Внесите 10 микролитров размороженных клеток в каждую предварительно охлажденную 1,5 миллилитровую пробирку. Аккуратно смешайте 10 микролитров компетентных клеток с одним микролитром сборочного продукта Gibson. Поместите трубочки на лед на 30 минут. Подвергните трубки тепловым ударом при температуре 42 градуса Цельсия в течение одной минуты, а затем охладите на льду в течение двух минут. Добавьте 100 микролитров предварительно подогретой среды SOC в каждую пробирку и встряхивайте при 250 об/мин в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, поместите клетки на агаровые пластины LB, содержащие 15 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола, и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На этом рисунке представлены репрезентативные результаты рестрикционного анализа плазмид UAS-кДНК/ORF, полученных с помощью системы CRISPRshuttle. В этом анализе рестрикционное расщепление 15 конструкций UAS-кДНК/ORF с PVU2 показало, что все образцы демонстрируют ожидаемые паттерны фрагментов примерно на 1072 парах оснований и 1820 парах оснований.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Эта статья представляет протокол для высокопроизводительного метода клонирования, известного как CRISPR-базируемное клонирование с передачей (CRISPRshuttle клонирование). Эта инновационная техника облегчает передачу фрагментов ДНК между векторами без необходимости амплифицирования ПЦР.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Генетическая инженерия
- Молекулярная биология
- CRISPR технология
Фон
- Традиционные методы клонирования часто требуют амплифицирования ПЦР.
- CRISPR технология революционизировала генетическую манипуляцию.
- Высокопроизводительные методы важны для крупномасштабных исследований.
- Эффективная передача векторов является важной для различных приложений.
Цель исследования
- Представить новый метод клонирования.
- Упростить процесс передачи фрагментов ДНК.
- Устранить необходимость в ПЦР в клонировании.
Использованные методы
- Разработка протокола CRISPRshuttle клонирования.
- Оценка эффективности передачи ДНК.
- Сравнение с традиционными методами клонирования.
- Применение метода в различных векторных системах.
Основные результаты
- Успешная передача фрагментов ДНК между векторами.
- Значительно сокращенное время и ресурсы по сравнению с методами ПЦР.
- Высокая эффективность, продемонстрированная в нескольких тестах.
- Потенциал для широких приложений в генетических исследованиях.
Выводы
- CRISPRshuttle клонирование является жизнеспособной альтернативой традиционным методам.
- Этот метод повышает эффективность в генетической инженерии.
- Будущие исследования могут использовать эту технику для сложных генетических манипуляций.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
High-throughput generation of genome-wide plasmid libraries is a critical enabler for systematic gene function studies and target validation in biopharma R&D. CRISPR-based shuttle cloning (CRISPRshuttle) eliminates PCR amplification, streamlining the transfer of DNA fragments between vectors and accelerating library construction. This capability enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assembly of genome-scale plasmid libraries for functional genomics screens.
- Supports systematic interrogation of gene function across diverse biological pathways.
- Facilitates biological de-risking and robust target validation by enabling high-throughput construct generation.
- Improves predictive confidence for downstream target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plasmid constructs for scalable screening workflows without PCR-induced sequence artifacts.
- Standardizes cloning outputs, supporting reproducibility and quantitative assay development.
- Accelerates readiness for high-throughput compound evaluation and phenotypic screening platforms.
- Enables efficient reuse of donor plasmid resources across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Streamlines the generation of disease-relevant genetic constructs for preclinical model development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid construct iteration.
- Reduces technical bottlenecks in translational biomarker and mechanistic studies.
- Enhances risk-adjusted advancement decisions by providing robust genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
CRISPRshuttle cloning integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless transition from hypothesis-driven gene selection to high-throughput construct generation and screening.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling rapid, scalable cloning of gene targets.
- Screening: Delivers standardized, PCR-free constructs for reproducible assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative outputs on cloning efficiency and construct integrity, supporting data-driven decision making.
- Translational Research: Facilitates the generation of constructs for disease-relevant models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput cloning platform for ongoing portfolio needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers high efficiency (>94%) and scalability, enabling rapid library generation by small teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by accelerating construct availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9-mediated cleavage and Gibson assembly techniques.
- Needs access to compatible donor plasmids and CRISPRshuttle-ready vectors.
- Demands standardized protocols for cross-team reproducibility and data integrity.
- Adaptation may be needed for diverse vector backbones or organism-specific systems.
- Efficiency and throughput are dependent on reagent quality and workflow optimization.
