Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы количественно оценить изменения в фагоцитарном процессе или действии в полимеризации после добавления агонистов или антагонистов. Это достигается за счет добавления флуоресцентно меченых частиц к фагоцитарным клеткам и предоставления достаточного времени для проведения фагоцитоза. В качестве второго шага по остановке фагоцитоза клетки обрабатывают триамовым синим, чтобы погасить флуоресценцию неинтернализованных частиц, промывают и позже фиксируют паральдегидом.

Далее идет окрашивание и количественная оценка. Чтобы облегчить флуоресцентное обнаружение клеток и частиц, клеток, получавших DPI или актин, результаты показывают влияние лечения на фагоцитоз и полимеризацию актина, количественно выраженное с помощью отношения зеленого красного флуоресценции к синему на основе флуорометрического анализа. Основное преимущество флуориметрического метода перед существующими методами заключается в том, что он является высокопроизводительным и экономически эффективным методом оценки фагоцитоза.

Это позволяет свести к минимуму манипуляции с образцами и быстро количественно определить интенсивность флуоресценции на клетку. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и клеточной биологии, например, насколько эффективен и насколько быстр клиренс этого патогена. Действие полимеризации изменяется при фагоцитозе и как фагоцитоз или полимеризация аксонов модулируются агонистами или антагонистами.

Чтобы начать процедурную пластину, макрофаги из клеточной линии Murine J 7 74 в 96-луночной пластине с прозрачным или черным дном инкубируют адгезивные клетки при 37 градусах Цельсия в течение одного-двух часов, чтобы обеспечить адион на планшете. Затем добавьте в клетки желаемые агонисты или антагонисты или средства контроля в двух х концентрациях в 50 микролитрах PBS или дополненной среды и инкубируйте в течение желаемого времени. На этом этапе убедитесь, что флуоресцентные частицы и этикетки всегда защищены от света во время обработки, промывки и инкубации.

Для предотвращения фотообесцвечивания следует использовать частицы в виде суспензии, например, флуоресцентно помеченных шариков dextra, или использовать стоковый раствор в течение одной минуты. Далее добавьте равное количество опсонизирующего реагента к флуоресцентным частицам и энергично вортируйте еще минуту. Впоследствии, инкубируя смесь при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, после инкубации центрифуги частицы должны составлять пять минут.

В 500 раз G. Удалите надосадочную жидкость S, содержащую избыток опсонизирующего реагента. После этого промойте частицы 100 микролитрами PBS. Сделайте образец вихревым способом, чтобы повторно суспендировать гранулу, и центрифугируйте его в течение пяти минут от 500 до G. Повторите эти шаги еще два раза, чтобы обеспечить надлежащую оптимизацию и удаление несвязанного антитела.

Чтобы приготовить рабочий раствор из ионизированных частиц, повторно суспендируйте частицы в пяти миллилитрах среды. Затем храните его в защищенном от света месте до дальнейшего использования. Теперь поместите рабочий раствор частиц в стерильный резервуар с реагентом.

Добавьте 50 микролитров частиц опсониза в подготовленные ранее клетки до конечной концентрации 15 нанограмм на миллилитр и позвольте фагоцитозу произойти в стандартных условиях культивирования клеток. При методе непрерывного фагоцитоза подождите от 30 минут до одного часа, чтобы флуоресцентные частицы достигли дна лунки и вступили в контакт с клетками. Если вы проводите эксперимент с течением времени, добавляйте бактерии через разные промежутки времени и останавливайте всю пластину реакций одновременно.

Чтобы увеличить скорость обработки для адгезионных клеток, удалите сеннет и добавьте 50 микролитров разбавленного триамового синего с PBS, чтобы погасить флуоресценцию неинтернализованных бактерий после трианной инкубации. Дважды промойте тарелку PBS, чтобы удалить остатки триана. Далее зафиксируйте клетки 50 микролитрами 4%-ного паральдегида и выдержите 15 минут при комнатной температуре.

Затем вымойте тарелку с помощью PBS. Удалите всю жидкость и добавьте 50 микролитров DPI После пяти минут окрашивания дважды промойте тарелку PBS. Впоследствии добавьте по 50 микролитров PBS в каждую лунку и зарегистрируйте фагоцитоз после фиксации паральдегида.

Дважды вымойте тарелку по 100 микролитров PBS на лунку для каждой промывки. Затем добавьте 50 микролитров 0,1% Triton X 100 в PBS в клетки для проникновения и инкубируйте их в течение трех-пяти минут при комнатной температуре. Затем дважды смойте 0,1%-ный Triton X с PBS.

Затем заблокируйте клетки 1%-ным БСА на 20 минут, чтобы избежать неспецифического связывания метки. Теперь приготовьте рабочий раствор Rod domine от красителя, добавив 100 микролитров стокового раствора метанола в пять миллилитров PBS. После блокировки немедленно извлеките раствор BSA.

Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров рубина и рабочий раствор и инкубируйте клетки в темноте в течение 20 минут комнатной температуры. Для количественной оценки фагоцитоза поместите планшет в считыватель флуоресцентных пластин Зарегистрируйте зеленую флуоресценцию с помощью фильтра возбуждения на длине волны 488 нанометров и эмиссионный фильтр на длине волны 518 нанометров, а синюю флуоресценцию с помощью возбуждающего фильтра на длине волны 355 нанометров и эмиссионный фильтр на длине волны 460 нанометров. Для количественной оценки полимеризации актина с помощью считывателя флуоресцентных пластин необходимо регистрировать красную флуоресценцию с помощью возбуждающего фильтра на длине волны 584 нанометра и эмиссионного фильтра на длине волны 620 нанометров и синей флуоресценции.

Фильтр огня и возбуждения на длине волны 355 нм и эмиссионный фильтр на длине волны 460 нм. Затем разделите общее значение РЧИ зеленой или красной флуоресценции на синюю флуоресценцию в зависимости от метки частицы или количественного определения фагоцитов в сравнении с актином из-за высокой пластины. Для определения дисперсии пластин используйте относительные индексы, чтобы наилучшим образом проиллюстрировать наблюдаемые тенденции и облегчить более надежный статистический анализ.

На этом изображении показаны изменения в полимеризации актина после добавления ингибитора. Это образование псевдоподий, а вот изменения в взъерошивании мембраны. На этом изображении клеткам было позволено интернализировать фитзи конъюгированные X-шарики в соотношении 20 к одному шарику к клетке в течение 60 минут.

Затем клетки промывают трианом и PBS, фиксируемым паральдегидом, проницаемым ацетоном и окрашивающим на F-актин С помощью палочкового домина, F-корейки и dpi, непрерывный фагоцитоз опсонизированных и неокисленных частиц вполне сопоставим. Где J 7 74 клетки интернализуют шарики dextra. Интересно, что полимеризация актина после фагоцитоза увеличивается, замедляясь в более поздние моменты времени, в то время как полимеризация актина после интернализации unop частиц не увеличивается, ни один из фагоцитарных методов с использованием dextra частиц не приводит к изменениям жизнеспособности клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать флуорметрический анализ в качестве эффективного, экономичного высокопроизводительного метода анализа фагоцитоза и других клеточных процессов.