Подготовка, Imaging, и количественное определение бактериальной поверхности моторики Анализы

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке подвижности бактериальной поверхности, называемой роением, стандартным и воспроизводимым способом. Это достигается путем предварительной подготовки и отверждения пластин подвижности поверхности. Вторым шагом является инокуляция планшетов для анализа подвижности поверхности бактериями и инкубация этих планшетов в контролируемой среде.

Затем модели роста бактерий на планшетных анализах визуализируются в режиме реального времени. Заключительным этапом процедуры является обработка изображений для количественной оценки. В конечном счете, эта процедура обеспечивает стандартизированный протокол подготовки планшетов для анализа подвижности поверхности для получения количественной динамической информации, такой как скорость расширения роя или распределение плотности биопродукта для поверхностных модальных бактерий.

Многие группы проводят анализы поверхностной подвижности. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы предоставляем систематический протокол, который сводит к минимуму множество переменных, которые могут привести к несогласованности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области подвижности поверхности бактерий, например, о том, как бактерии колонизируют различные типы поверхностей.

Хотя этот метод может дать представление о роевой подвижности Pseudomonas с некоторыми модификациями, он также может быть применен для изучения других поверхностных модальных бактерий. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что небольшие изменения в протоколе или лабораторных условиях могут сильно повлиять на результаты роевого анализа. Демонстрировать процедуру будет Морган, аспирант из моей лаборатории.

Чтобы начать протокол, приготовьте агросмесь, смешав 200 миллилитров FAB за вычетом сульфата аммония роевой среды, 0,9 грамма благородного агара и 0,2 грамма кайнокислот в бутылке с фильтрующим материалом объемом 500 миллилитров. Используйте пластину для перемешивания для тщательного перемешивания среды. Затем простерилизуйте носитель в автоклаве при температуре 121,1 градуса Цельсия в течение 22 минут с опцией быстрой вентиляции.

Сразу после стерилизации закрутите крышку бутылки со средой, чтобы предотвратить испарение воды. Поместите среду на магнитную пластину для перемешивания и охладите АНД до 50 градусов Цельсия при температуре окружающей среды при активном перемешивании. Если агар будет использоваться в более позднем экспериментальном периоде времени, его можно держать в тепле на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия или в инкубаторе в течение 15 часов без активного перемешивания.

Когда среда достигнет приблизительно 50 градусов Цельсия при двух миллилитрах стерилизованной глюкозы, используя стандартные стерильные методы, тщательно перемешайте с помощью магнитной мешалки, чтобы предотвратить образование пузырьков в среде. В капюшоне с помощью стерильной серологической пипетки можно закачать 7,5 миллилитров эдии в отдельные 60-миллиметровые чашки Петри. Если требуется большая площадь роящейся поверхности, добавьте 25 литров эдиа в 100-миллиметровые чашки Петри.

Оставьте всю посуду нештабелированной и проверьте вытяжку с помощью уровня «яблочко», чтобы обеспечить ровную горизонтальную поверхность для затвердевания агара. Для 60-миллиметровых тарелок отставьте в сторону крышки посуды и высушите незакрытый агар в вытяжке в течение 30 минут. Более крупные 100-миллиметровые посуды потребуют более длительного времени отверждения.

Влажность, воздушный поток и температура в данной лаборатории могут потребовать проверки времени отверждения для оптимального роения бактерии. После высыхания APL следует немедленно инокулировать клетками, которые были предварительно выращены отдельно до желаемой фазы роста. Для начала выберите изолированную колонию бактерий из свежей пластины LB и внесите в нее шесть миллилитров культуры. Медиа.

Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с горизонтальным встряхиванием. На следующий день инокулируйте от одного до пяти микролитров ночной культуры на высушенные роевые агаровые пластины, протыкая поверхность агара стерильной зубочисткой или проволочной иглой для инокуляции, в зависимости от штамма бактерий, перенесите пластины для анализа роя в инкубатор с температурой, установленной либо 30 градусов Цельсия, либо 37 градусов Цельсия, или 42 градуса по Цельсию. Переверните пластины таким образом, чтобы лишняя влага конденсировалась на крышке пластины, а не на агаре, уравновесьте бактерии при определенных температурах напряжения в течение двух или четырех часов непосредственно перед покадровой съемкой.

Затем перенесите планшеты в устройство визуализации in vivo таким образом, чтобы бактерии на поверхности агри были направлены вниз к перевернутой камере устройства. Заполните все крышки чашек Петри небольшим количеством воды. Затем поместите каждую крышку стороной воды вверх поверх перевернутых пластин AER.

Внутри блока формирования изображения загерметизируйте корпус формирования изображения для поддержания постоянного уровня влажности, отрегулируйте настройки изображения устройства формирования изображения и начните покадровую съемку активности роя. После получения изображений в режиме реального времени динамика роения бактерий может быть проанализирована с помощью стандартного анализа изображений, такого как Image J в эксперименте по поверхностной подвижности. Анализ содержания влаги в агаре непосредственно перед посевом имеет решающее значение для достижения успешных результатов роения.

В оптимальном тоне пластины AER будут способствовать плотному пятну инокуляции и усиливать активность роения бактерий, в то время как пересушенные пластины будут подавлять подвижность поверхности. Помимо содержания влаги, наличие или отсутствие добавок в среде также может влиять на роение бактерий в зависимости от температуры инкубации за счет использования штаммов бактерий, экспрессирующих люминесценцию или флуоресцентные белки. Динамику роевой конкуренции между двумя разными видами бактерий можно запечатлеть в покадровой видеосъемке. Кроме того, изменения в локальной плотности клеток и скорости биосинтеза липидов, способствующих подвижности в бактериальном рое, также могут быть установлены и количественно оценены с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии.

Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как конфокальная микроскопия, могут быть использованы для того, чтобы ответить на вопросы о поведении отдельных клеток и провести детальный, микроскопический и микроскопический анализ подвижности поверхности бактерий. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выполнить стандартный и воспроизводимый роевой анализ и получить всесторонний анализ поверхностной подвижности бактерий путем подготовки, отверждения и инокуляции анализов поверхностной подвижности, а также обработки и анализа результата в закономерностях роста бактерий.