Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран
25 февраля 2015 г.
Рыбок данио кератоциты мигрировать в клеточных листов из эксплантов и обеспечить модель в пробирке для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте эпителия заживления ран. Эти протоколы деталь эффективный способ создать первичные культуры эксплантов для использования в коллективных анализов клеточной миграции.
Общей целью этой процедуры является создание эксплан-культур кератоцитов рыбок данио для использования в исследованиях коллективной миграции клеток и заживления эпителиальных ран. Это достигается путем предварительного удаления чешуи с прикрепленной эпителиальной тканью у взрослой рыбки данио, находящейся под наркозом. Чешуйки с прикрепленной тканью помещаются в чашку для культивирования, чтобы позволить клеткам прилипнуть.
Затем питательная среда добавляется вместе с любыми обработками, указанными в экспериментальном дизайне. Наконец, клетки инкубируются и наблюдаются с помощью видеомикроскопии в течение желаемого периода времени. В конечном счете, различные анализы могут быть использованы для демонстрации изменений в миграции или клеточной морфологии, а также экспрессии белков или других маркеров с течением времени.
Основное преимущество этого метода перед существующим методом, таким как метод трансформации клеточных культур, заключается в том, что культуры эксплантов являются первичными, которые тесно пересобираются до свойств клетки in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заживления эпителиальных ран, такие как роль коллективной миграции и переход от эпителия к мезенхимальному. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что чешуйки могут не прикрепляться к поверхности роста или могут не расти в любой конкретной культуре.
Демонстрировать эту процедуру будут студент-медик Хосе Рап ПанИН, Хана Ти и Агнес Паскуале, старшие научные сотрудники моей лаборатории. Чтобы подготовиться к этому эксперименту, дехлорируйте примерно 1,5 литра водопроводной воды, используя либо коммерческий дехлорирующий агент, либо дав воде постоять в течение 24 часов, затем используйте 500 миллилитров, чтобы наполнить каждый из трех литровых стаканов. Пометьте один стакан для удержания рыбы перед любой процедурой, а второй для восстановления — для третьего стакана.
Добавьте 100 микрограмм на миллилитр трики. Для обезболивания рыб наполните неглубокий лоток льдом. Прогрейте культуру средней до комнатной температуры и соберите чистые ювелирные пинцеты.
Очистите пинцет, погрузив кончики в 70% этанол и пропустив их через горелку Бунзена, дав этанолу сгореть. Поймайте нужное количество рыбы и поместите в стакан для хранения. Переложите одну рыбу в стакан для анестезии.
Обезболив рыбу согласно текстовому протоколу, переложите ее на лед и расположите горизонтально хвостом к руке, держащей пинцет. Чтобы снять чешую, расположите пинцет параллельно рыбе. Когда кончик находится на краю чешуи, слегка прижмите плоскую сторону пинцета к боку рыбы, чтобы чешуя поднялась над телом рыбы.
С помощью пинцета ухватитесь за чешую, затем сорвите ее и, не переворачивая, поместите в чашку для культуры тканей. Повторите процедуру, удалив максимум 12 чешуек у крупной взрослой особи, избегая жаберной области, боковой линии и плавников. Поместите рыбу в стакан для восстановления и следите за тем, чтобы она восстановилась от последствий анестезии.
Затем пересадите рыб в отдельный аквариум и дайте рыбам восстановиться в течение 21 дня, чтобы обеспечить полную регенерацию чешуи. В зависимости от эксперимента размещайте до 20 весов на один пластик. 35-миллиметровая культура тканей обрабатывается в чашке, или от четырех до шести чешуек на стакан.
Подложите нижнюю чашу, дайте чешуе прилипнуть к чашке, прежде чем аккуратно добавить 1,2 миллилитра готовой среды в каждую чашку для культуры. Инкубировать культуры X explan при температуре 28 градусов Цельсия в течение нужного периода времени с обработкой или без нее для проведения микроскопии. Вынув из инкубатора чашку с клеточными листами, поместите ее в предметный столик микроскопа.
Используйте объектив с четырьмя x для первоначальной фокусировки, чтобы облегчить съемку изображений с течением времени. Отметьте расположение каждой ячейки листа и/или ориентацию блюда на сцене. Сфотографируйте листы клеток в различные моменты времени в соответствии с протоколом эксперимента, и если для эксперимента нужны только неподвижные изображения, поместите их обратно в инкубатор.
Для фиксации образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии готовят и предварительно подогревают растворы при комнатной температуре. Чтобы просмотреть участки OSE под флуоресценцией, используйте стеклянное дно 35-миллиметровой посуды для выращивания баклажанов так, как описано ранее в этом видео, не удаляя питательную среду, добавьте в каждую посуду 0,8 миллилитра 4%-ного паральдегида в 1,1 XPBS. Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем аспирируйте раствор. Добавьте в каждую посуду дополнительно по 0,8 миллилитра фиксатора, а после второй пятиминутной инкубации отсасывайте раствор. Если не используются внешние лиганды или эпитопы, проникните в клетки, добавив 0,5 мл 0,2% TRITTON X 100 в одну инкубацию XPBS в течение пяти минут.
Перед удалением раствора добавьте 0,5 миллилитра 1% БСА в один XPBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа или при четырех градусах Цельсия в течение ночи после инкубации, отаскайте раствор и приступайте к окрашиванию антителами. В качестве альтернативы добавьте от одного до двух миллилитров 1% BSA в один XPBS и храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-четырех недель. Проводят иммунофлюоресценцию.
Согласно текстовому протоколу, показанному здесь, можно наблюдать, как листы кератоцитов мигрируют из-под чешуи в течение нескольких часов после создания культуры EXPLAN. Иногда можно наблюдать индивидуально мигрирующий кератиноцит, который отделился от коллективно мигрирующего листа. Начальная скорость продвижения листа чрезвычайно быстра, но эта скорость быстро замедляется по мере того, как клетки распространяются в течение первых 48 часов культивирования.
Быстрое увеличение не связано с пролиферацией клеток, так как после мечения в течение 24 часов флуоресцентным EDU примерно 10% клеток демонстрируют признаки деления клеток, что намного ниже, чем в трансформированных клеточных линиях. Когда лечение добавляется в момент установления X-эксплана, некоторые соединения изменяют коллективную миграцию клеток. Например, как показано здесь, некоторые ингибиторы MMP уменьшают площадь клеточного листа через 24 часа.
В культуре, когда растворимый RGD, содержащий пептид, добавляют в культуральную среду для нарушения образования адгезии, хромота на переднем крае листа быстро сжимается, а затем передний край листа отделяется и втягивается, и менее чем за две минуты можно оценить локализацию белков внутри листа или в литровых и последующих клетках, Весь лист можно закрепить и покрасить, как показано на этом рисунке. После освоения этой техники ее можно выполнить за 10-15 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о добавлении предварительно подогретой питательной среды только после того, как даст время цитам прилипнуть к чашке для культивирования После этой процедуры.
Другой метод, такой как КПЦР, может быть выполнен для ответа на любой дополнительный вопрос, такой как изменения экспрессии генов в зависимости от времени и/или условий лечения. Понаблюдав за этой процедурой, вы должны иметь гораздо лучшее представление о том, как установить экспланирующие культуры IDE для использования в различных процедурах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод создания эксплантатных культур кератоцитов данио-рерио, которые служат моделью in vitro для изучения коллективной миграции клеток и заживления эпителиальных ран. Процедура включает удаление чешуи с прикрепленной эпителиальной тканью у взрослых особей zebrafish и их культивирование для наблюдения за поведением клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Миграция клеток
- Заживление эпителиальных ран
- Модели на zebrafish
Введение
- Кератоциты Danio rerio способны к коллективной миграции.
- Понимание механизмов коллективной миграции имеет решающее значение для исследований заживления ран.
- Модели in vitro обеспечивают контролируемую среду для проведения экспериментов.
- Видеомикроскопия позволяет детально наблюдать за поведением клеток.
Цель исследования
- Для создания первичных культур эксплантов кератоцитов данио-рерио.
- Для исследования механизмов коллективной миграции клеток.
- Для оценки клеточной морфологии и экспрессии белков в динамике.
Используемые методы
- Удаление чешуи с прикрепленной эпителиальной тканью у zebrafish.
- Помещение чешуи в культуральные чашки для адгезии клеток.
- Добавление культуральной среды и введение экспериментальных воздействий.
- Инкубация и наблюдение с помощью видеомикроскопии.
Основные результаты
- Успешное создание культур эксплантатов.
- Наблюдение за динамикой коллективной миграции клеток.
- Оценка изменений морфологии клеток с течением времени.
- Анализ экспрессии белков, связанных с миграцией.
Выводы
- Метод культуры эксплантатов эффективен для изучения поведения кератоцитов.
- Данная модель может расширить понимание процессов заживления эпителиальных ран.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения терапевтических возможностей применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эксплантаты кератоцитов Danio rerio представляют собой первичную модель in vitro для изучения коллективной миграции клеток и эпителиально-мезенхимального перехода — процессов, имеющих непосредственное значение для заживления ран кожи и регенерации тканей. Данная система позволяет снизить риски при изучении механизмов действия терапевтических мишеней, связывая динамику миграции клеток с определенными изменениями в экспрессии генов, что повышает прогностическую достоверность валидации мишеней. Совместимость модели с мутантными и трансгенными линиями Danio rerio позволяет точно исследовать функцию белков в путях миграции, что помогает в принятии решений на ранних этапах поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование терапевтических гипотез путем установления связи между механизмами клеточной адгезии и переключением режимов миграции в генетически модифицируемой системе.
- Практическая ценность: Использование культур первичных эксплантатов, которые максимально точно воспроизводят поведение кератоцитов in vivo, что снижает трансляционную неоднозначность при валидации мишеней.
- Научная ценность: Оценка влияния генетических пертурбаций на коллективную миграцию и эпителиально-мезенхимальный переход, что способствует функциональному снижению рисков при выборе мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание стандартизированных, воспроизводимых культур эксплантатов для количественной оценки динамики миграции и морфологических изменений с течением времени.
- Практическая ценность: Обеспечение возможности скрининга соединений, модулирующих миграцию, таких как ингибиторы ММП или пептиды, нарушающие адгезию, с наблюдаемыми эффектами на целостность пласта и динамику переднего края.
- Научная ценность: Использование видеомикроскопии в режиме тайм-лапс и иммунофлуоресценции для получения многопараметрических данных с целью стандартизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирование процессов реэпителизации при заживлении кожных ран, что обеспечивает создание релевантной системе заболевания модели для доклинической оценки мишеней.
- Практическая ценность: Мониторинг экспрессии генов, связанных с заживлением ран и воспалением, в ходе эпителиально-мезенхимального перехода для согласования биомаркеров.
- Научная ценность: Изучение того, как эксплантаты со временем теряют способность к коллективной миграции, что отражает переходы in vivo и позволяет принимать обоснованные решения о продвижении проекта с учетом рисков.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, в частности, для показаний, связанных с заживлением ран и фиброзом, где коллективная миграция является ключевым патогенетическим механизмом.
- Открывательная биология: позволяет проверять гипотезы о роли межклеточных адгезий в определении режима миграции и прояснять молекулярные связи между индивидуальной и коллективной миграцией.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу первичных культур с количественными показателями скорости и направления миграции, площади клеточного пласта и стабильности переднего края при различных вариантах воздействия.
- Аналитика: позволяет измерять морфологию клеток, локализацию белков и изменения экспрессии генов с течением времени, что способствует сравнению условий на основе полученных данных.
- Трансляционные исследования: связывает ранние фенотипы миграции с доклиническим этапом через экспрессию генов, связанных с заживлением ран, что позволяет разрабатывать стратегии поиска трансляционных биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изучения механизмов миграции на различных генетических фонах, сокращая необходимость в избыточной разработке моделей.
Влияние на операционную деятельность и предприятие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет устранения неопределенности механизмов путей миграции.
- Практическая ценность: предлагает стандартизированную, воспроизводимую систему первичных культур с возможностью масштабирования для применения на мутантных и трансгенных линиях.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности ранней оценки влияния мишеней на коллективную миграцию и эпителиальную пластичность.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе функциональной валидации в модели, релевантной для заживления ран.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с данио-рерио, эксплантации чешуи и методы стерильного культивирования тканей.
- Необходимо наличие доступа к виварии для содержания zebrafish, инкубаторам для культур, видеомикроскопии и инфраструктуре для иммунофлуоресцентного анализа.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация времени адгезии чешуи и условий культивирования между разными пользователями и лабораториями.
- При адаптации метода следует оптимизировать плотность расположения чешуи и тип чашки (пластиковая или стеклянная) в зависимости от требований анализа миграции.
- Практические ограничения включают неудачное отделение чешуи и вариабельность успеха разрастания тканей, что зависит от состояния здоровья рыб и мастерства исполнения техники.
