Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран

Общей целью этой процедуры является создание эксплан-культур кератоцитов рыбок данио для использования в исследованиях коллективной миграции клеток и заживления эпителиальных ран. Это достигается путем предварительного удаления чешуи с прикрепленной эпителиальной тканью у взрослой рыбки данио, находящейся под наркозом. Чешуйки с прикрепленной тканью помещаются в чашку для культивирования, чтобы позволить клеткам прилипнуть.

Затем питательная среда добавляется вместе с любыми обработками, указанными в экспериментальном дизайне. Наконец, клетки инкубируются и наблюдаются с помощью видеомикроскопии в течение желаемого периода времени. В конечном счете, различные анализы могут быть использованы для демонстрации изменений в миграции или клеточной морфологии, а также экспрессии белков или других маркеров с течением времени.

Основное преимущество этого метода перед существующим методом, таким как метод трансформации клеточных культур, заключается в том, что культуры эксплантов являются первичными, которые тесно пересобираются до свойств клетки in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заживления эпителиальных ран, такие как роль коллективной миграции и переход от эпителия к мезенхимальному. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что чешуйки могут не прикрепляться к поверхности роста или могут не расти в любой конкретной культуре.

Демонстрировать эту процедуру будут студент-медик Хосе Рап ПанИН, Хана Ти и Агнес Паскуале, старшие научные сотрудники моей лаборатории. Чтобы подготовиться к этому эксперименту, дехлорируйте примерно 1,5 литра водопроводной воды, используя либо коммерческий дехлорирующий агент, либо дав воде постоять в течение 24 часов, затем используйте 500 миллилитров, чтобы наполнить каждый из трех литровых стаканов. Пометьте один стакан для удержания рыбы перед любой процедурой, а второй для восстановления — для третьего стакана.

Добавьте 100 микрограмм на миллилитр трики. Для обезболивания рыб наполните неглубокий лоток льдом. Прогрейте культуру средней до комнатной температуры и соберите чистые ювелирные пинцеты.

Очистите пинцет, погрузив кончики в 70% этанол и пропустив их через горелку Бунзена, дав этанолу сгореть. Поймайте нужное количество рыбы и поместите в стакан для хранения. Переложите одну рыбу в стакан для анестезии.

Обезболив рыбу согласно текстовому протоколу, переложите ее на лед и расположите горизонтально хвостом к руке, держащей пинцет. Чтобы снять чешую, расположите пинцет параллельно рыбе. Когда кончик находится на краю чешуи, слегка прижмите плоскую сторону пинцета к боку рыбы, чтобы чешуя поднялась над телом рыбы.

С помощью пинцета ухватитесь за чешую, затем сорвите ее и, не переворачивая, поместите в чашку для культуры тканей. Повторите процедуру, удалив максимум 12 чешуек у крупной взрослой особи, избегая жаберной области, боковой линии и плавников. Поместите рыбу в стакан для восстановления и следите за тем, чтобы она восстановилась от последствий анестезии.

Затем пересадите рыб в отдельный аквариум и дайте рыбам восстановиться в течение 21 дня, чтобы обеспечить полную регенерацию чешуи. В зависимости от эксперимента размещайте до 20 весов на один пластик. 35-миллиметровая культура тканей обрабатывается в чашке, или от четырех до шести чешуек на стакан.

Подложите нижнюю чашу, дайте чешуе прилипнуть к чашке, прежде чем аккуратно добавить 1,2 миллилитра готовой среды в каждую чашку для культуры. Инкубировать культуры X explan при температуре 28 градусов Цельсия в течение нужного периода времени с обработкой или без нее для проведения микроскопии. Вынув из инкубатора чашку с клеточными листами, поместите ее в предметный столик микроскопа.

Используйте объектив с четырьмя x для первоначальной фокусировки, чтобы облегчить съемку изображений с течением времени. Отметьте расположение каждой ячейки листа и/или ориентацию блюда на сцене. Сфотографируйте листы клеток в различные моменты времени в соответствии с протоколом эксперимента, и если для эксперимента нужны только неподвижные изображения, поместите их обратно в инкубатор.

Для фиксации образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии готовят и предварительно подогревают растворы при комнатной температуре. Чтобы просмотреть участки OSE под флуоресценцией, используйте стеклянное дно 35-миллиметровой посуды для выращивания баклажанов так, как описано ранее в этом видео, не удаляя питательную среду, добавьте в каждую посуду 0,8 миллилитра 4%-ного паральдегида в 1,1 XPBS. Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем аспирируйте раствор. Добавьте в каждую посуду дополнительно по 0,8 миллилитра фиксатора, а после второй пятиминутной инкубации отсасывайте раствор. Если не используются внешние лиганды или эпитопы, проникните в клетки, добавив 0,5 мл 0,2% TRITTON X 100 в одну инкубацию XPBS в течение пяти минут.

Перед удалением раствора добавьте 0,5 миллилитра 1% БСА в один XPBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа или при четырех градусах Цельсия в течение ночи после инкубации, отаскайте раствор и приступайте к окрашиванию антителами. В качестве альтернативы добавьте от одного до двух миллилитров 1% BSA в один XPBS и храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех-четырех недель. Проводят иммунофлюоресценцию.

Согласно текстовому протоколу, показанному здесь, можно наблюдать, как листы кератоцитов мигрируют из-под чешуи в течение нескольких часов после создания культуры EXPLAN. Иногда можно наблюдать индивидуально мигрирующий кератиноцит, который отделился от коллективно мигрирующего листа. Начальная скорость продвижения листа чрезвычайно быстра, но эта скорость быстро замедляется по мере того, как клетки распространяются в течение первых 48 часов культивирования.

Быстрое увеличение не связано с пролиферацией клеток, так как после мечения в течение 24 часов флуоресцентным EDU примерно 10% клеток демонстрируют признаки деления клеток, что намного ниже, чем в трансформированных клеточных линиях. Когда лечение добавляется в момент установления X-эксплана, некоторые соединения изменяют коллективную миграцию клеток. Например, как показано здесь, некоторые ингибиторы MMP уменьшают площадь клеточного листа через 24 часа.

В культуре, когда растворимый RGD, содержащий пептид, добавляют в культуральную среду для нарушения образования адгезии, хромота на переднем крае листа быстро сжимается, а затем передний край листа отделяется и втягивается, и менее чем за две минуты можно оценить локализацию белков внутри листа или в литровых и последующих клетках, Весь лист можно закрепить и покрасить, как показано на этом рисунке. После освоения этой техники ее можно выполнить за 10-15 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о добавлении предварительно подогретой питательной среды только после того, как даст время цитам прилипнуть к чашке для культивирования После этой процедуры.

Другой метод, такой как КПЦР, может быть выполнен для ответа на любой дополнительный вопрос, такой как изменения экспрессии генов в зависимости от времени и/или условий лечения. Понаблюдав за этой процедурой, вы должны иметь гораздо лучшее представление о том, как установить экспланирующие культуры IDE для использования в различных процедурах.