Живая изображения клеточных Экструзия из эпидермиса развивающихся данио рерио

Поддержание эпителиальных тканей требует непрерывного удаления поврежденных и отмирающих клеток без нарушения барьерной функции. Для этого эпителиальные клетки выдавливаются путем формирования и сжатия кольца актина и миозина в клетке, окружающей умирающую клетку, чтобы вытолкнуть его и закрыть любые пробелы, которые могли возникнуть в результате его выхода. В этой видеостатье Метод индуцирования и визуализации экструзии апоптотических клеток из эпидермиса личинок рыб зебры в режиме реального времени.

Показано, что это достигается путем введения красного флуоресцентного белка, меченного F-актиновым зондом, в одну из клеточных стадий трансгенных эмбрионов данио-рерио, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок в эпидермисе для визуализации действующих филаментов в эпителиальных тканях. На четвертый день после персонализации личинки, экспрессирующие как GFP, так и RFP, затем обрабатывают G four 18, чтобы вызвать апоптоз в эпидермисе. Динамика актина и изменения формы эпителиальных клеток, происходящие во время экструзии, визуализируются с помощью покадровой визуализации на конфокальном микроскопе с вращающимся диском.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как иммуносиловые и анализы, заключается в том, что мы можем наблюдать быстрые изменения и динамику актина, которые происходят в процессе экструзии в живой эпителиальной ткани. В этом видео мы покажем вам процедуру визуализации экструзии апоптотических клеток из эпидермиса развивающихся рыбок данио в режиме реального времени. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории, чтобы понять, как клетки координируют перестраивать свой актоновый цитоскелет для удаления апоптотических клеток, сохраняя при этом барьерную функцию, и как нарушение процесса экструзии может привести к определенным болезненным состояниям.

Итак, приступим: чтобы визуализировать динамику действий во время экструзии клеток в эпидермисе развивающихся рыбок данио, начните с размораживания ранее транскрибированной РНК на льду. Мы транскрибируем Mr.mРНК, кодирующую красный флуоресцентный белок, слитый с тельпой в домене гомологии утрофина и действующий в связывающем белке. Добавьте феноловый красный в РНК в соотношении один к одному, чтобы конечная концентрация РНК составила около 30 нанограммов на микролитр, и загрузите один микролитр раствора в вытянутую капиллярную иглу путем обратного заполнения.

Соберите около 75 эмбрионов 1-клеточной стадии C-K-G-F-P в буфере E three. Пипеткой для микроинъекций поместите собранные эмбрионы в форму для микроинъекций с помощью пипетки для пасты на пять и три четверти и аккуратно сориентируйте эмбрионы в кормушке с помощью FST Dumont. В-пятых, щипцы работают быстро, чтобы избежать необходимости вводить РНК многоступенчатым эмбрионам под стандартным лабораторным препарирующим стереомикроскопом.

Используйте микроинжектор с контролируемым давлением, чтобы ввести РНК в ярмо эмбрионов в виде ископаемого фенола. После инъекции у эмбриона должен быть виден красный цвет. Обязательно вводите не менее 50 эмбрионов для каждого эксперимента.

Отсортируйте эмбрионы, чтобы удалить все неоплодотворенные или поврежденные яйца, и инкубируйте все оставшиеся эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия. Через 24 часа используйте флуоресцентный препарирующий микроскоп для отбора эмбрионов рыбок данио, которые имеют высокий уровень флуоресценции GFP в эпидермисе и RFP, меченную действующей флуоресценцией. Инкубируйте отобранные эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы приступить к медикаментозному лечению, чтобы вызвать воздействие аминогликозида на апоптоз

Антибиотик G 4 18 или лекарственное средство вызывает выдавливание апоптотических клеток из эпидермиса развивающихся личинок рыбок данио. Важно отметить, что это лечение работает только на личинках, которые спустя четыре дня после оплодотворения и старше вызывают экструзию клеток. Соберите до 25 личинок данио-рерио через 4 дня после оплодотворения, экспрессирующих как GFP, так и RFP, в чашку для культуры размером 35 на 10 миллиметров, содержащую три миллилитра среды Етри.

Осторожно замените среду на три миллилитра Е, содержащие один миллиграмм на миллилитр G четырех 18 и выдержите личинку в препарате в течение четырех часов в темноте при температуре 28 градусов Цельсия. Затем извлеките среду и замените ее на предварительно подогретые три среды, содержащие 0,02% трики, и приступайте к монтажу личинок для крепления личинок для визуализации. Перенесите до трех личинок в 1,5-миллилитровую пробирку фендора и удалите большую часть Е трех сред.

С помощью разрезанного наконечника пипетки 120 микролитров 1%-ного низкого расплава поступает в пробирочную смесь. А затем аккуратно нанесите личинки и смесь на покровное стекло на дно чашки для выращивания матеха. Используя держатель булавки FST с прикрепленным вставным штифтом или вольфрамовой иглой, быстро сориентируйте личинки так, чтобы они были прямыми и плоскими на фоне покровного стекла.

Дайте аосе застыть. Затем аккуратно наполните форму Е тремя средами, содержащими 0,02% трики. Мы обнаружили, что весь процесс экструзии апоптотических клеток из эпидермиса развивающихся личинок данио-рерио занимает примерно 20 минут.

В этой статье мы продемонстрируем, как организовать эксперимент по покадровой визуализации с использованием конфокального микроскопа с вращающимся диском и программного обеспечения и/или IQ для сбора серии Z-плоскостей через один слой эпидермиса рыбки данио. Во-первых, включите аргоновый и гелий-неоновый лазеры, камеру микроскопа и эпифлуоресцентную лампу в программном обеспечении and или IQ. Создайте протокол временных рядов, содержащий длины волн, которые необходимо изобразить.

Частота интервалов между снимками и количество повторений захвата Осторожно поместите маттековую чашку с образцом на предметный столик микроскопа, а затем используйте объектив с 20-кратным увеличением и проходящим светом, чтобы сфокусироваться на личинках. Переместите объектив для погружения в воду 40 раз в правильное положение. Используя эту цель, мы можем отснять примерно от 20 до 25 клеток на поле, что позволяет нам следить за поведением клеток во время экструзии, а также разрешать динамику субклеточного действия.

Осторожно нанесите каплю воды на верхнюю часть объектива 40 раз и быстро поставьте сверху тарелку для маттеков. Определите образец с помощью светлопольного освещения, а затем используйте эпифлуоресценцию 488 нанометров, чтобы сфокусироваться конкретно на положительном эпидермисе GFP. Переключитесь в режим конфокального сканирования.

Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции для каждого из каналов соответственно. Позаботьтесь о том, чтобы сбалансировать мощность лазера и время воздействия для оптимального обнаружения сигнала и предотвращения фототоксичности. Чтобы идентифицировать выдавливающиеся клетки, используйте эпифлуоресценцию для визуализации эпидермиса, меченного GFP, и идентифицируйте группу клеток в классическом узоре розетки, состоящую из набора клеток, окружающих небольшую круглую клетку посередине.

Кроме того, должно быть скопление помеченного RFP актина, видимое в виде кольца вокруг маленькой круглой клетки посередине, что является отличительной чертой экструзии клеток. После идентификации экструзионной ячейки быстро установите верхний и нижний пределы для серии Z и размер шага. Затем начните сбор четырех наборов D-конфокальных данных для просмотра данных и визуализации сокращения актинового кольца и поведения эпителия, которые происходят вокруг умирающей клетки.

Со временем сделайте 3D-проекции серии Z и сохраните данные в виде файла фильма. Этот шаг можно выполнить с помощью различных программных пакетов. На этом рисунке показана экспрессия RFP UTR CH в эпидермисе личинок данио-рерио через четыре дня после оплодотворения CK GFP.

Здесь все еще кадрируются проекции Z из фильма с замедленной съемкой, которые следуют за динамикой живой актерской игры. В процессе экструзии эпителиальных клеток стрелками обозначено кольцо актина, образованное соседними клетками, которое сжимается и закрывается в течение двух минут. После этой процедуры мы можем использовать другие методы в сочетании с этой техникой, такие как использование химических ингибиторов или генетических мутаций, чтобы лучше понять, как изменение экструзии может привести к определенным болезненным состояниям.

тем, что апоптотические клетки не удалось очистить, мы только что показали вам, как организовать эксперимент с покадровой визуализацией для визуализации процесса экструзии из эпидермиса развивающейся рыбки данио. При выполнении этой процедуры важно не забывать ограничивать количество света, на который попадает ваш образец, чтобы предотвратить обесцвечивание или токсичность фотографий. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.