Biofunctionalized берлинская лазурь Наночастицы для мультимодальных молекулярной визуализации приложений

Общая цель данной процедуры заключается в синтезе биофункционализированных наночастиц берлинской лазури для использования в качестве мультимодальных агентов молекулярной визуализации. Это достигается путем первоначального синтеза наночастиц берлинской лазури, содержащих ионы гадолиния или марганца, которые усиливают сигнал МРТ. На втором этапе на поверхность наночастиц присоединяется флуоресцентный авадон, что обеспечивает возможность флуоресцентной визуализации.

Затем наночастицы с покрытием из авидона биофункционализируют с помощью соответствующих биотинилированных антител для таргетинга на определенные клетки. Заключительным этапом является контроль качества биофункционализированных наночастиц путем измерения их размера, дзета-потенциала и временной стабильности. В конечном итоге биофункционализированные наночастицы применяются в мультимодальной молекулярной визуализации для обнаружения специфической целевой популяции клеток в смеси с помощью флуоресцентной визуализации и МРТ.

Современные коммерческие контрастные вещества обычно одномодальны и обеспечивают разрешение только на анатомическом уровне. Наночастицы берлинской лазури сочетают в себе два взаимодополняющих режима визуализации — МРТ и флуоресценцию, что позволяет проводить молекулярную визуализацию на субклеточном уровне. Применение мультимодальных наночастиц распространяется на диагностику рака и воспалительных заболеваний, а также на мониторинг ответа на проводимую терапию.

Это объясняется тем, что биофункционализированные наночастицы могут прицельно воздействовать и связываться с популяцией клеток в определенной области организма. Хотя данный метод позволяет получить ценные сведения для диагностики рака и воспалительных заболеваний, а также для оценки ответа на терапию, он может быть применен и при других патологических состояниях, при которых будет полезна чувствительность и специфичность молекулярной визуализации. Используя флуоресценцию и МРТ, мы впервые задумали создать такие наночастицы, когда определили, что берлинская лазурь — агент, одобренный FDA для перорального применения человеком, — может быть стабильно синтезирована с помощью одностадийной схемы синтеза и надежно биофункционализирована с использованием стандартных методов биоконъюгации.

Для начала приготовьте 5 мМ раствор гексацианоферрата(II) калия в 5 мл деионизированной воды (раствор А), затем приготовьте раствор B, содержащий 2,5 мМ хлорида железа(III) и 2,5 мМ хлорида марганца(II) в 10 мл деионизированной воды, для синтеза наночастиц берлинской лазури на основе марганца. Другие наночастицы могут быть синтезированы согласно текстовому протоколу. Перенесите раствор B в круглодонную колбу и перемешивайте раствор при 1000 об/мин при комнатной температуре.

С помощью перистальтического насоса по каплям добавьте раствор А в сосуд со скоростью 10 мл/час. После завершения добавления раствора А перемешивайте смесь при 1000 об/мин в течение дополнительных 30 минут. Затем перенесите аликвоты смеси объемом 1 мл в микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку 0,2 мл 5 мМ раствора хлорида натрия.

Центрифугируйте пробирки при 20 000 ×g в течение не менее 10 минут, затем осторожно удалите супернатант, оставив осадок наночастиц. Далее к каждому осадку добавьте 1 мл деионизированной воды. Используйте микрокончик для равномерного суспендирования наночастиц в растворе с помощью соникации.

Промойте наночастицы еще минимум три раза, чтобы удалить из суспензии компоненты исходной реакции после финального центрифугирования; после покрытия наночастиц флуоресцентным красителем, как описано в текстовом протоколе, ресуспендируйте наночастицы в одном миллилитре деионизированной воды. Извлеките из холодильника запасы биотинилированных антител. Используйте антинейрональный глиальный антиген 2 и анти-человеческий эотаксин 3. Перенесите биотинилированное антитело в нейлоновый микроцентрифужный фильтр 0,2 мкм, затем центрифугируйте пробирку при 14 000 ×g в течение 10 минут.

Затем добавьте антитела в количестве не более 0,05 mg на mg наночастиц, покрытых Aden, и оберните пробирки алюминиевой фольгой для защиты от света. Инкубируйте пробирки при осторожном перемешивании в течение двух-четырех часов при 4 °C. После прикрепления антител добавьте 10 µL образца наночастиц с концентрацией 1 mg/mL к 990 µL деионизированной воды в одноразовую пластиковую пробирку, закройте ее крышкой и перемешайте путем вортексирования.

Затем определите средний размер наночастиц с помощью системы динамического рассеяния света с углом измерения 173 градуса. Начните с приготовления суспензий клеток в PBS объемом 10 мл с концентрацией примерно 100 000 клеток на мл; для пробирок со смешанными культурами, содержащих различные соотношения каждой клеточной линии, следует готовить суспензии согласно текстовому протоколу. В каждую пробирку добавьте 2 мл 5% БСА для блокировки клеток и минимизации неспецифического связывания. Затем добавьте в каждую пробирку 1 мл биофункционализированных наночастиц в концентрации 1 мг/мл и инкубируйте смесь в течение одного часа.

Затем промойте клетки для удаления несвязавшихся наночастиц, центрифугируя пробирки при 1000 ×g в течение пяти минут и ресуспендируя осадок в 1 мл PBS. Повторите этот процесс еще как минимум дважды. Фиксируйте клетки, используя 10% формальдегид в PBS, затем добавьте 10 µg/ml семиаминоактинина и мицина D в PBS для окрашивания клеток; инкубируйте пробирку на льду в течение 30 минут, после чего промойте клетки PBS.

Затем загрузите образец в проточный цитофлуориметр и проанализируйте 10 000 гейтированных клеток из каждого образца. Аналогичная процедура визуализации клеток, связанных с флуоресцентными наночастицами, с помощью лазерной конфокальной микроскопии описана в текстовом протоколе. Для начала доведите клетки в колбах T 75 примерно до 80% конфлюэнтности, затем промойте клетки пятью миллилитрами PBS для удаления среды.

Добавьте пять миллилитров 1% BSA в PBS и заблокируйте клетки в течение одного часа. Затем добавьте в колбу пять миллилитров наночастиц, покрытых антителами, в концентрации 0,5 мг/мл, и инкубируйте клетки в течение одного часа для связывания наночастиц. Далее трижды промойте клетки пятью миллилитрами PBS, чтобы удалить несвязанные наночастицы.

Затем добавьте 2 мл 0,25% раствора трипсин-ЭДТА и инкубируйте клетки в течение пяти минут, чтобы отделить их от стенки флакона. Добавьте 8 мл DMEM для нейтрализации трипсина, после чего перенесите клеточную суспензию в центрифужные пробирки. Центрифугируйте при 1000 ×g в течение пяти минут для осаждения клеток.

Затем аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Добавьте один миллилитр 10% формальдегида в PBS для фиксации клеток, после чего перенесите 100 µL каждого образца в отдельные лунки плоского 96-луночного планшета. Добавьте в каждую лунку 100 µL расплавленного 1% агарозы в деионизированной воде и перемешайте, несколько раз втягивая и вытесняя жидкость пипеткой.

Оставьте гель затвердевать при температуре 4 °C в течение 12 часов для получения фантома. После затвердевания геля поместите фантом в горизонтальный клинический магнит с индукцией 3 Т рядом с цельным кубическим блоком 2% агара размером 150 см. Затем зафиксируйте фантом и блок агара в центре восьмиканальной HD-катушки для головного мозга; для измерения времен релаксации используйте корональные срезы толщиной 0,5 мм, выполненные на средней высоте 96-луночного планшета. Для определения гидродинамического диаметра полученных наночастиц применялись анализы динамического рассеяния света. Исследования стабильности подтвердили долгосрочную стабильность наночастиц в экспериментах как в водной среде, так и в средах для культивирования клеток.

Лазерная конфокальная микроскопия показала, что флуоресцентные наночастицы, нагруженные антителами к EOT three, специфически связываются с поверхностью клеток EOL one. При использовании антител к NG two они специфически связывались с поверхностью нейросфер BSG. Биофункционализированные наночастицы позволили успешно провести флуоресцентное мечение популяции целевых клеток, что было подтверждено методом проточной цитометрии.

Кроме того, наночастицы были способны воздействовать на специфическую субпопуляцию клеток в смеси даже при низком соотношении целевых клеток к контрольным. Наконец, биофункционализированные наночастицы усилили МРТ-контраст целевых клеток — клеток, обработанных наночастицами, нагруженными nng. Два антитела продемонстрировали гиперинтенсивность в Т1-взвешенных последовательностях по сравнению с клетками, обработанными контрольными частицами.

Напротив, две наночастицы A NNG продемонстрировали гипоинтенсивность в T2-взвешенных последовательностях по сравнению с контрольными частицами. Синтез биофункционализированных наночастиц берлинской лазури может быть завершен в течение двух дней при условии правильного выполнения процедуры.

Аналогично данной процедуре, наночастицы могут быть биофункционализированы различными биополимерами и таргетными лигандами для исследования новых заболеваний и состояний. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать наночастицы берлинской лазури для использования в флуоресцентной визуализации и имиджинге с целью маркировки популяций клеток. Не забудьте строго соблюдать правила техники безопасности и стандартные операционные процедуры при проведении исследований в клиническом МРТ-томографе.