Biofunctionalized берлинская лазурь Наночастицы для мультимодальных молекулярной визуализации приложений

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе биофункционализированных наночастиц прусского синего цвета для использования мультимодальных агентов молекулярной визуализации. Это достигается путем синтеза наночастиц прусского синего, содержащих ионы гадолиния или марганца, которые усиливают сигнал МРТ. Вторым шагом является прикрепление флуоресцентного авадона к поверхности наночастиц, что придает возможность флуоресцентной визуализации.

Затем наночастицы, покрытые авадоном, биофункционализируются желаемой клеткой, нацеленной на биотинилированные антитела. Последним шагом является проверка контроля качества биофункционализированных наночастиц путем измерения их размера, дзета-потенциала и временной стабильности. В конечном счете, биофункционализированные наночастицы используются в мультимодальных приложениях молекулярной визуализации для визуализации конкретной целевой популяции клеток в смеси с помощью флуоресцентной визуализации и МРТ.

Современные коммерческие средства визуализации, как правило, являются одномодовыми и обеспечивают разрешение только на анатомическом уровне. Наночастицы прусского синего цвета сочетают в себе два взаимодополняющих режима визуализации: МРТ и флуоресценцию и позволяют проводить молекулярную визуализацию и субклеточный уровень. Применение мультимодальных наночастиц распространяется на диагностику рака и воспалительных заболеваний в дополнение к мониторингу их реакции на лечение.

Это связано с тем, что биофункционализированные наночастицы могут нацеливаться и связываться с популяцией клеток в определенной области тела. Хотя этот метод может дать представление о диагностике рака и воспалительных заболеваний и ответе на лечение, он также может быть применен к другим патологическим состояниям, которые выиграют от чувствительности и специфичности молекулярной визуализации. Используя флуоресценцию и МРТ, у нас впервые возникла идея создания этих наночастиц, когда мы определили, что одобренный FDA препарат для перорального использования человеком может быть стабильно синтезирован с использованием однокомпонентной схемы синтеза и надежно биофункционализирован с использованием стандартных методов биоконъюгации.

Для начала приготовьте 5 миллионов молярного раствора гекса калия и двух из пяти миллилитров деионизированной воды, чтобы сделать раствор А следующим ремонтным раствором В, содержащим 2,5 миллимоляра железа, три хлорида и 2,5 миллимоляра марганца. Два хлорида в 10 миллилитрах деионизированной воды для синтеза наночастиц марганца прусского синего. Другие наночастицы можно синтезировать, как указано в текстовом протоколе: перенести раствор В в колбу с круглым дном А и перемешать раствор со скоростью 1000 об/мин при комнатной температуре.

С помощью перистальтического насоса добавляют раствор А по каплям в сосуд со скоростью 10 миллилитров в час. После того, как добавление раствора А будет завершено, перемешайте смесь при 1000 об/мин еще 30 минут. Затем переложите по одному миллилитру аликвоты смеси в микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку по 0,2 миллилитра пяти миллилитров хлорида натрия.

Центрифугируйте пробирки при 20 000 умноженных на G в течение не менее 10 минут, а затем осторожно удалите супинат, оставив гранулу наночастиц. Далее в каждую гранулу добавьте по одному миллилитру деионизированной воды. Используйте микронаконечник, чтобы равномерно суспендировать наночастицы в растворе с помощью ультразвука.

Промойте наночастицы еще не менее трех раз, чтобы удалить компоненты начальной реакции из суспензии после окончательного отжима, повторно суспендируйте наночастицы в одном миллилитре деионизированной воды после покрытия наночастиц флуоресцентным берном, как описано в текстовом протоколе, удалите запасы биотинилированных антител из холодильника. Здесь. Используйте антинейронный глиальный антиген 2 и античеловеческий эотаксин 3. Перенесите биотинилированное антитело в нейлоновый микрофильтр толщиной 0,2 микро, а затем центрифугируйте пробирку при 14 000 G в течение 10 минут.

Затем добавьте меньше или равно 0,05 миллиграмма антитела на миллиграмм наночастиц, покрытых покрытием Адена, и накройте пробирки алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света. Инкубируйте пробирки с легким встряхиванием в течение двух-четырех часов при температуре четыре градуса Цельсия. После присоединения антител добавьте 10 микролитров одного миллиграмма на миллилитр наночастицы образца в 990 микролитров деионизированной воды в одноразовую пластиковую вете, крышку вете и в-то перемешайте.

Ну а затем определить средний размер наночастиц с помощью системы динамического рассеяния света с углом измерения 173 градуса. Начните с приготовления 10 миллилитровых суспензий клеток в PBS в концентрации приблизительно 100 000 клеток на миллилитр для смешанных культур, пробирки, содержащие различные соотношения каждой клеточной линии, должны быть приготовлены, как описано в текстовом протоколе, в количестве двух миллилитров 5% BS, A на каждую пробирку для блокирования клеток и минимизации неспецифического связывания. Затем добавьте один миллилитр или один миллиграмм на миллилитр, биофункционализируйте наночастицы в каждую пробирку и инкубируйте смесь в течение часа.

Затем промойте клетки от несвязанных наночастиц, вращая пробирки при 1000-кратном G в течение пяти минут и снова сгибая гранулы в одном миллилитре PBS. Повторите этот процесс еще как минимум два раза. Зафиксируйте клетки с помощью 10% формальдегида в PBS, а затем добавьте 10 микрограммов на миллилитр, семь аминоактина и мицин D в PBS, чтобы окрашивать клетки, инкубируйте пробирку на льду в течение 30 минут, а затем промойте клетки PBS.

Далее загрузите образец в проточный цитометр и проанализируйте 10 000 закрытых клеток из каждого образца. Аналогичная процедура получения изображений клеток, связанных с флуоресцентными наночастицами с помощью лазерной конфокальной микроскопии, описана в текстовом протоколе. Для начала носите клетки в колбах T 75 примерно до 80% конфлюенции, а затем промойте клетки от среды пятью миллилитрами PBS.

Добавьте пять миллилитров 1% BSA в PBS и заблокируйте клетки на один час. Затем добавьте в колбу пять миллилитров наночастиц, покрытых антителами, по 0,5 миллиграмма на миллилитр и инкубируйте клетки в течение одного часа, чтобы позволить наночастицам связаться. Затем трижды промойте клетки пятью миллилитрами PBS, чтобы удалить несвязанные наночастицы.

Затем добавьте два миллилитра 0,25% раствора трипсина ЭДТА и инкубируйте клетки в течение пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы. Добавьте восемь миллилитров DMEM, чтобы погасить триин, а затем перенесите клеточную суспензию в центрифужные пробирки. Вращайте их со скоростью 1000 G в течение пяти минут, чтобы гранулировать ячейки.

Далее аспирируйте супинат и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Добавьте один миллилитр 10% формальдегида в PBS для фиксации клеток, а затем перелейте по 100 микролитров каждого образца в отдельные лунки 96-луночной пластины с плоским дном. Добавьте 100 микролитров расплавленного 1%aros в деионизированную воду в каждую лунку и перемешайте пипетированием вверх и вниз.

Дайте гелю застыть при четырех градусах Цельсия в течение 12 часов, чтобы образовался фантом. После того, как гель застынет, поместите фантом в горизонтальный клинический магнит с тремя Тл рядом с твердым кубическим блоком размером 150 сантиметров из 2%агара. Затем закрепите фантом и агаровый блок в центре восьмиканальной катушки мозга HD для измерения времени релаксации с использованием корональных срезов толщиной 0,5 миллиметра, взятых на средней высоте 96 лунок Для определения гидродинамического диаметра генерируемых наночастиц были использованы анализы динамического рассеяния света Исследования подтвердили долгосрочную стабильность наночастиц и используются как в экспериментах на водной основе, так и в экспериментах на клеточных средах.

Лазерная конфокальная микроскопия показала, что флуоресцентные наночастицы, загруженные антителами к EOT 3, обнаружены на поверхности клеток EOL One. Когда используются антитела к НГ-2, они специфически связываются с поверхностью нейросфер БСЖ. Биофункционализированные наночастицы смогли успешно флуоресцентно помечать популяцию клеток-мишеней, измеренную с помощью проточной цитометрии.

Кроме того, наночастицы были способны нацеливаться на определенную субпопуляцию клеток в смеси даже в клетках с низким уровнем мишени, чтобы контролировать соотношения клеток. Наконец, биофункционализированные наночастицы увеличивали контраст МРТ клеток-мишеней, клеток, обработанных наночастицами, загруженными NNG. Два антитела показали гиперинтенсивность в взвешенных последовательностях T one по сравнению с клетками, обработанными контрольными частицами.

В противоположность этому, наночастицы A NNG two придавали гипоинтенсивность взвешенным последовательностям T two по сравнению с контрольными частицами. Один раз мастера. Синтез биофункционализированных наночастиц презионного синего цвета может быть завершен в течение двух суток при условии его правильного выполнения.

Подобно этой процедуре, наночастицы могут быть биофункционализированы с помощью различных биополимеров и целевых лигандов для исследования новых заболеваний и новых состояний. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как синтезировать наночастицы берлинского синего для флуоресценции и визуализации для мечения популяции клеток. Не забывайте неукоснительно следовать рекомендациям по технике безопасности и стандартным операционным процедурам при проведении исследований в клиническом магните для МРТ.