Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

Общая цель этой процедуры заключается в выделении внеклеточных везикул с помощью бумажной платформы. Это достигается путем предварительного ламинирования двумя листами полистирола с круглой целлюлозой, вырезы из бумаги выравниваются по массиву зарегистрированных сквозных отверстий. Второй шаг заключается в химическом конъюгировании молекул, которые связывали бы внеклеточные везикулы с зоной бумажного теста.

Затем биологический образец может быть помещен пипеткой непосредственно в тестовую зону для бумаги, а после этапа промывки выделяются внеклеточные везикулы. Заключительным этапом является характеристика захваченных внеклеточных везикул с помощью электронной микроскопии, Элизы или транскриптомного анализа. В конечном счете, субпопуляции внеклеточных везикул из образцов сыворотки объемом всего 10 микролитров могут быть очищены и концентрированы.

Таким образом, основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как ультраобучение, заключается в том, что она гораздо более щадящая сборка и проста в выполнении. Демонстрацией процедуры будет заниматься аспирант вы. Начиная с двух листов полистирола, создайте массив круглых вырезов.

Каждый из них имеет диаметр менее пяти миллиметров с ручным дыроколом или автоматизированным плоттером CAD. Кроме того, вырезают серию из хроматографии диаметром пять миллиметров, бумажные диски с дыроколом. Положите один лист полистирола на скамейку и наложите по одному бумажному диску поверх каждого соответствующего сквозного отверстия.

Прослоите бумажные диски, прописав и наложив второй лист полистирола. Проверьте общее выравнивание перед склеиванием сэндвича в термоламинаторе. Затем начните химическую модификацию поверхности бумажных дисков, вставив ламинированное устройство в плазменную камеру.

Кратковременно активируйте поверхность бумаги кислородной плазмой, при выходе из камерного вакуума немедленно переведите бумажное устройство в раствор цилиндра и инкубируйте в течение 30 минут. Установите комнатную температуру. Удалите излишки си, промыв устройство пятью миллилитрами 200-градусного этанола.

Затем инкубируйте устройство с раствором линкера A-G-M-B-S в течение 15 минут. Установите комнатную температуру. Удалите излишки молекулы линкера с помощью обильного количества промывателей этанолом.

Затем инкубируйте устройство с авадоном в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия и удалите несвязанный авадон с помощью пятимиллилитровой промывки PBS. Затем устройство может перейти либо к этапу связывания антител, либо храниться при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех недель, если это необходимо. После прикрепления Адена нанесите пипеткой 10 микролитров блокирующего раствора на открытые участки диска бумаги и инкубируйте бумагу в течение 10 минут.

При комнатной температуре повторите добавление 10 микролитров блокирующего раствора и 10-минутную инкубацию при комнатной температуре. Еще два раза для завершения биофункционализации подвергшейся воздействию бумажной подложки пипеткой 10 микролитров биотинилированных захватывающих молекул помещают на диски и инкубируют в течение 10 минут При комнатной температуре для внеклеточных везикул предпочтительными молекулами захвата могут быть либо антитела против CD 63, либо xin 5. Повторите пипетирование по 10 микролитров и 10-минутный процесс инкубации.

Еще два раза после захвата молекулы прикрепите. Смойте излишки остатков с помощью пипетирования. Нанесите по 10 микролитров соответствующего буфера для промывки на каждый бумажный диск.

Инкубируйте промывку в течение одной минуты при комнатной температуре и повторите 10 микролитров промывки и одну минуту инкубации еще два раза. Полностью функциональное бумажное устройство теперь готово для выделения внеклеточных везикул из сыворотки или водянистой влаги для обработки сыворотки. Соберите 10 миллилитров периферической крови в вакуумную пробирку и аккуратно переверните пробирку пять раз.

Поместите трубку в вертикальное положение и подождите 30 минут. Установите комнатную температуру, центрифугируйте образец крови в течение 15 минут. Установите комнатную температуру.

Переложите верхний прозрачный слой сыворотки в чистую пластиковую пробирку и выбросьте нижнюю полутвердую фазу. Осветляйте сыворотку при более высокой скорости центрифугирования в течение 30 минут. Установите комнатную температуру.

Перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку и удалите мелкие частицы, пропустив надосадочную жидкость через фильтр 0,8 микрометра. Полученную отфильтрованную сыворотку можно использовать сразу или хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия. Если необходимо извлечь внеклеточные везикулы из влаги, соберите водистую влагу непосредственно у пациентов с помощью инвазивных процедур и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия.

До начала использования не требуется никаких этапов фильтрации или осветления образцов стекловидного тела. Чтобы изолировать внеклеточные везикулы из сыворотки или водянистой влаги, нанесите пипеткой пять микролитров биологического образца на каждый диск биофункционализированной бумажной субстраты. Инкубируйте пятно в течение одной минуты при комнатной температуре и повторите процессы пипетирования в пять микролитров и одну минуту инкубации.

Еще два раза после аффинного связывания прополощите несвязанные пузырьки, предварительно пипетировав 10 микролитров соответствующего буфера для промывки. Инкубируйте буфер в течение одной минуты при комнатной температуре и повторите промывку объемом 10 микролитров и последующую инкубацию. Сделайте еще два шага.

Захваченные внеклеточные везикулы теперь готовы к следующим последующим анализам для фиксации захваченных везикул на функционализированной бумажной подложке пипетки объемом 10 микролитров 0,5 x karnofsky fixator на каждом бумажном диске. Дайте реакции сшивания протекать при комнатной температуре в течение 10 минут и промойте все диски обильным количеством PBS в течение пяти минут. Затем обезвоживайте бумажные подложки, применяя следующие смывки по порядку.

Одна инкубация 35% этанола, две инкубации 50% этанола, две инкубации 70% этанола, две инкубации 95% этанола и четыре инкубации 100% этанола. Для каждой отдельной промывки дайте раствору этанола инкубироваться на бумажных дисках при комнатной температуре в течение 10 минут. Когда бумага устройства высохнет до костей, покройте образцы 18-нанометровым слоем палладиевого золота в металлическом распылении.

Поместите образец в сканирующий электронный микроскоп и проведите микроскопию при напряжении в пять киловольт, чтобы предотвратить чрезмерную зарядку биологического образца и обнаружить захваченные везикулы с помощью иммунологических анализов. Начните с добавления пяти микролитров первичного антитела против CD 9 на каждый бумажный диск и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты. Удалите все несвязанные антитела, промыв бумажное устройство 30 миллилитрами PBS комнатной температуры путем механического перемешивания.

Далее пипеткой нанесите на каждую бумагу по пять микролитров пероксидазы хрена и конъюгированного вторичного антитела. Диск и инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты. Промойте устройство 30 миллилитрами PBS путем механического перемешивания, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.

Наконец, добавьте пять микролитров смеси цвета и метрической основы на каждую бумагу.Диск. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 20-30 минут и отсканируйте полученное изменение интенсивности плашечного цвета с помощью настольного сканера. Для начала изолируйте отдельные бумажные диски от объемного устройства, вырезав участки излишков полистирольного ламината с помощью ножниц или бритвенного лезвия.

Поместите каждый бумажный диск в чистую микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров. На два лиза захваченные везикулы путем добавления 265 микролитров лизисного буфера. И по 35 мкл полисахаридного носителя на основе ПВП в каждую трубку энергично вихревой.

Чтобы обеспечить полный везикул, лизис и вытеснение высвободившихся молекул РНК, добавьте в вихрь лизата 30 микролитров раствора гомогената для перемешивания и инкубируйте пробирку на льду в течение 10 минут. Затем добавьте 330 микролитров смеси кислотного фенолахлороформа в лизат, чтобы обеспечить правильное фазоспецифическое разделение РНК как белков, так и вихря ДНК в течение не менее 15 секунд на каждую пробирку. Центрифугируйте пробирку на полной скорости в течение пяти минут.

При комнатной температуре перенесите РНК, содержащую верхнюю водную фазу, в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте нижнюю органическую фазу. Добавьте 1,25 водных объема 100% этанола в РНК и быстро перемешайте. Затем нанесите смесь на коммерческую колонку для экстракции твердой РНК.

Центрифугируйте пробирку в течение 15 секунд при комнатной температуре и сбросьте проточную фракцию. Вымойте колонку, добавив 700 микролитров рабочего раствора. Во-первых, центрифугируйте пробирку в течение 5-10 секунд и отбросьте поток.

Далее промойте колонку 500 микролитрами рабочего раствора. Во-вторых, центрифугируйте пробирку в течение пяти-10 секунд. Откажитесь от потока и повторите стирку еще раз.

Удалите остатки этанола с помощью последнего одноминутного отжима при комнатной температуре и переложите высушенную экстракционную колонку в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 100 микролитров предварительно подогретой воды без R RNA. Центрифугируйте пробирку на полной скорости в течение 5-10 секунд и при необходимости выбросьте верхнюю колонну экстракции.

Сконцентрируйте и дополнительно очистите ЭИТ РНК с помощью коммерческого набора для очистки РНК с использованием биотина с флуоресцентной меткой. В качестве репортера по поверхностной иммобилизации. Эффективность и специфичность протокола функционализации бумаги можно увидеть, сравнив высокую флуоресценцию, возникающую на модифицированной поверхности сшивающего агента по сравнению с нефункционализированными бумажными поверхностями.

Более того, когда репортерная молекула заменяется биотинилированным антителом против CD 63, правильно функционализированный бумажный субстрат будет способствовать более высокой скорости захвата внеклеточных везикул по сравнению с негативным контрольным бумажным субстратом. Когда различные захватывающие молекулы иммобилизуются на бумажных подложках, различные подгруппы внеклеточных везикул, по-видимому, демонстрируют различное распределение по размерам с помощью бумажного устройства. Можно также провести анализ как на содержание внутрипузырной РНК, так и на обилие специфических поверхностных белков везикул.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать и обслуживать рост при внеклеточном вирусе с помощью бумажного устройства.