Упрощенная система для оценки клеточной Mechanosensing и Durotaxis In Vitro

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы создать упрощенную систему для анализа клеточной твердой оболочки, с помощью которой многие клетки млекопитающих преимущественно мигрируют в сторону более жесткого субстрата. Это достигается путем предварительного получения подложек из полиметилсубоксана или PDMS определенной жесткости. Далее подготовленный PDMS заливается в каждую лунку шестилуночной пластины и удаляются любые пузырьки воздуха.

Затем камеры Durex завершаются установкой стерилизованной крышки на верхнюю часть PDMS в каждой лунке для создания наложения. Последним шагом является посев клеток в камеры Duro tax с такой плотностью, которая дает клеткам достаточно места для миграции без существенного взаимодействия с другими клетками. В конечном счете, микроскопия живых клеток используется для изучения оксиса в мигрирующих клетках.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как полиакриламид, заключается в том, что существует один шаг между мягким PDMS и жестким стеклом вместо градиентных гелевых альтернатив. Также покрытие PDMS внеклеточным матриксом Такие компоненты, как фибронектин, не требуют химической сшивки, которая требуется для полиакриламидных гелей. Чтобы приготовить одну шестилуночную культуральную пластину для тканей, сначала разорвите весы с помощью конической трубки объемом 50 миллилитров

Отвесьте примерно 10 грамм полидиметилсубоксана или базового раствора PDMS в 50-литровой пробирке. Для подложки 90 к одному разделите измеренный вес базового раствора PDMS на 90. Чтобы определить необходимое правильное количество раствора сшивающего агента, добавьте рассчитанное количество раствора сшивающего агента PDMS в тубу, энергично перемешанную смесь оснований A-P-D-M-S в течение пяти минут при комнатной температуре.

Используя на этом этапе небольшой шпатель, смесь будет содержать небольшое количество пузырьков воздуха. Центрифугируйте субстрат PDMS в настольной центрифуге в течение пяти минут 50 раз. G. Добавьте комнатную температуру, чтобы удалить пузырьки, если они все еще есть.

После пятиминутного центрифугирования снова пифугируйте пипеткой: один миллилитр субстрата 90 к одному PDMS в каждую лунку обрабатываемой культуры ткани. Шестилуночная пластина. Любые оставшиеся пузырьки воздуха, присутствующие в PDMS, могут быть устранены на этом этапе, если лопнуть их иглой 21 калибра.

Дайте PDMS распределиться в лунке в течение 30 минут. Далее вскипятить 12-миллиметровый стакан номер один, накрыть крышкой в дистиллированной воде на пять минут, всего три раза. Поместите по одной высушенной крышке в каждую лунку планшета для культуры тканей, осторожно коснувшись одной стороны крышки.

Вставьте его в раствор PDMS, а затем, опустив защитное стекло на PDMS. По мере того, как покровное стекло оседает, PDMS начинает вторгаться за края покровного стекла, но не будет полностью его закрывать. Это создаст интерфейс между PDMS и стеклом после отверждения.

Инкубируйте пластину при температуре 70 градусов Цельсия в духовке в течение 16 часов, чтобы выдержать PDMS. Наконец, поместите планшет в колпак для клеточных культур и стерилизуйте ультрафиолетом в течение 10 минут. Покройте каждую дюроксовую камеру одним миллилитром фибронектина в фосфатно-солевом буфере без кальция и магния в течение одного часа при температуре 30 градусов Цельсия.

Убедитесь, что вся поверхность погружена в раствор фибронектина в PBS. Приготовьте тепловой 1%-ный бычий сывороточный альбумин или БСА, весом 0,5 грамма БСА и растворив его в 50 миллилитрах фильтра PBS. Стерилизуйте раствор через точечный фильтр 22 мкм перед нагреванием до 80 градусов Цельсия в течение 12 минут.

Далее отсадите раствор фибронектина и трижды промойте камеры PBS. Добавьте в каждую лунку один миллилитр тепло денатурированного BSA в PBS и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, трипсиновых глазах и подсчитайте выбранные клетки, пока камеры durex блокируются теплом. Денатурированный раствор аспирата БСА из камер непосредственно перед нанесением покрытий на ячейки.

Пластину 10 000 клеток в объеме два миллилитра в каждую лунку доаксиальной камеры. Используя среду, необходимую для конкретного типа выбранных клеток, дайте клеткам прилипнуть и распределиться на субстрате в течение четырех часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2, выполните визуализацию живых клеток на инвертированном микроскопе с использованием фазового контраста с объективом 10-кратного увеличения. Микроскоп должен быть оснащен закрытой камерой для увлажнения окружающей среды, позволяющей контролировать температуру на уровне 37 градусов Цельсия и 5% CO2 во время длительной визуализации.

Визуализация: после того, как клетки разойдутся примерно на 3,5 часа, соберите пластину в камере микроскопа. Дайте образцам сбалансироваться в камере в течение 30 минут. Настройте автоматическое многоточечное посещение на микроскопе, если оно есть.

Сосредоточьтесь на границе между PDMS и защитной крышкой стекла и выберите точки для изображения по всему интерфейсу. При среднем значении 40 точек на изображение камеры Durex, ячейки каждые 10 минут в течение 16 часов, интересующая область будет отображаться в виде двух линий, внешняя линия которых соответствует краю покровного стекла, а внутренняя линия соответствует фактической границе между PDMS и покровным листом. Чтобы проанализировать данные, сгенерируйте таблицу, подобную той, что показана в текстовом протоколе.

Подсчитайте количество событий перехода от PDMS к стеклянной поверхности и наоборот из каждого созданного фильма. Событие пересечения определяется как прохождение ядра клетки через границу между PDMS и стеклом в любом направлении. Запишите количество событий пересечения в соответствующий столбец таблицы Excel для количественной оценки нескольких пересечений.

Подсчитайте количество раз, когда ячейка пересекала интерфейс. Это число должно быть записано в столбце Excel, соответствующем подложке, на которой была расположена ячейка в конце фильма. Повторите анализ для каждой ячейки, пересекающей интерфейс в фильме.

Исключите ячейки, которые выходят за пределы поля зрения во время формирования образа. Рассчитайте процент клеток, которые мигрировали из PDMS на поверхность стекла и поэтому подверглись Duro Texas. Для этого.

Сложите количество событий пересечения от мягкого к сложному и несколько событий пересечения, которые закончились на сложном, и разделите на общее количество событий пересечения. Рассчитайте процент множественных скрещиваний, разделив общее количество множественных скрещиваний на общее количество скрещиваний, чтобы начать понимать молекулярный механизм, с помощью которого клетки соответствуют механическим сигналам в окружающей среде. Специфические белки могут быть сбиты с помощью IRNA, как показано здесь.

Около 70% клеток контрольной группы, обработанных ирнками, демонстрировали акксис. В противоположность этому, когда разрыв CD был сбит с помощью РНК-интерференции, у клеток не было предпочтений относительно того, мигрируют ли они на твердый или мягкий субстрат. Кроме того, ячейки с зазором CD пересекли границу кратно.

В то время как контрольные клетки, обработанные ирнками, обычно пересекают границу только после одного репрезентативного следа контроля. Клетки ирнк показывают, что клетки, как правило, мигрируют через границу один раз и предпочтительно остаются на более жесткой поверхности по сравнению с зазором CD. Ирнк обрабатывала клетки, которые не проявляли предпочтения ни к одной из жесткостей и пересекали границу несколько раз.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить подложки PDMS, собрать камеры duris и количественно оценить налоги DUR.