Упрощенная система для оценки клеточной Mechanosensing и Durotaxis
27 августа 2015 г.
Многие клетки млекопитающих преимущественно мигрируют в сторону более жесткой матрицы или субстрата через дуротаксис. Целью данного протокола является создание простой системы in vitro, которая может быть использована для изучения и манипулирования поведением дюротаксиса клеток путем включения подложек из полидиметилсилоксана (PDMS) определенной жесткости, сопряженных со стеклянными покровными стеклами.
Общая цель данной процедуры заключается в создании упрощенной системы для анализа таксиса клеток, при котором многие клетки млекопитающих преимущественно мигрируют в сторону более жесткого субстрата. Это достигается путем предварительного приготовления субстратов из полиметилсилоксана (PDMS) определенной жесткости. Затем подготовленный PDMS заливают в каждую лунку планшета на шесть лунок и удаляют все пузырьки воздуха.
Затем камеры Durex дорабатываются путем размещения стерилизованного покровного стекла поверх PDMS в каждой лунке для создания перекрытия. Заключительным этапом является посев клеток в камеры Durex с такой плотностью, чтобы клетки имели достаточно пространства для миграции без значительного взаимодействия с другими клетками. В конечном итоге для изучения аксонов в мигрирующих клетках используется микроскопия живых клеток.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как полиакриламид, является наличие единого перехода между мягким PDMS и жестким стеклом вместо альтернатив с градиентным гелем. Кроме того, покрытие PDMS компонентами внеклеточного матрикса, такими как фибронектин, не требует химического сшивания, которое необходимо для полиакриламидных гелей. Для подготовки одной 6-луночной планшета для культивирования тканей сначала уравновесьте весы с помощью конической пробирки объемом 50 мл.
Взвесьте примерно 10 грамм базового раствора полидиметилсилоксана (PDMS) в пробирке объемом 50 миллилитров. Для получения подложки с соотношением 90:1 разделите измеренную массу базового раствора PDMS на 90. Чтобы определить необходимое количество раствора сшивающего агента, добавьте вычисленный объем раствора сшивающего агента PDMS в пробирку и энергично перемешивайте смесь базового раствора и сшивающего агента PDMS в течение пяти минут при комнатной температуре.
При использовании небольшого шпателя на этом этапе в смеси может появиться небольшое количество пузырьков воздуха. Центрифугируйте подложку из PDMS в настольной центрифуге в течение пяти минут при 50 ×g. Если пузырьки воздуха все еще присутствуют, выдержите при комнатной температуре для их удаления.
После центрифугирования в течение пяти минут перенесите по 1 мл субстрата PDMS (в соотношении 90:1) в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования тканей. Любые оставшиеся пузырьки воздуха в PDMS можно удалить на этом этапе, проколов их иглой калибра 21G.
Дайте PDMS распределиться по лунке в течение 30 минут. Затем трижды прокипятите покровные стекла №1 диаметром 12 мм в дистиллированной воде по пять минут за каждое кипячение. Поместите одно сухое покровное стекло в каждую лунку планшета для культивирования тканей, осторожно касаясь одного края стекла.
Поместите покровное стекло в раствор PDMS, а затем опустите его на поверхность PDMS. По мере того как покровное стекло будет опускаться, PDMS начнет растекаться за его края, но не покроет его полностью. Это создаст интерфейс между PDMS и стеклом после отверждения.
Инкубируйте планшет в печи при 70 °C в течение 16 часов для полимеризации PDMS. Затем поместите планшет в ламинарный бокс для культивирования клеток и подвергните УФ-стерилизации в течение 10 минут. Покройте каждую камеру durox одним миллилитром фибронектина в фосфатно-солевом буфере без кальция и магния в течение одного часа при 30 °C.
Убедитесь, что вся поверхность полностью погружена в раствор фибронектина в PBS. Приготовьте термоденатурированный 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA), взвесив 0,5 грамма BSA и растворив его в 50 миллилитрах фильтрованного PBS. Стерилизуйте раствор через фильтр с порами 0,22 мкм перед нагреванием при 80 °C в течение 12 минут.
Затем аспирируйте раствор фибронектина и трижды промойте камеры PBS. Добавьте в каждую лунку один миллилитр термоденотурированного BSA в PBS и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре; в это время, пока камеры блокируются термоденотурированным BSA, обработайте клетки трипсином и подсчитайте количество необходимых клеток. Аспирируйте раствор BSA из камер непосредственно перед высевом клеток.
Высейте 10 000 клеток в объеме двух миллилитров в каждую лунку камеры doax. Используя среду, необходимую для выбранного типа клеток, дайте клеткам прикрепиться и распределиться по подложке в течение четырех часов в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2, затем проведите визуализацию живых клеток на инвертированном микроскопе в фазовом контрасте с использованием объектива 10x. Микроскоп должен быть оснащен закрытой увлажненной камерой, позволяющей контролировать температуру при 37 °C и уровень 5% CO2 во время длительной визуализации.
Для проведения визуализации, после того как клетки распластались в течение примерно 3,5 часов, поместите планшет в камеру микроскопа. Дайте образцам стабилизироваться в камере в течение 30 минут. Если микроскоп поддерживает данную функцию, настройте автоматический многоточечный обход.
Сосредоточьтесь на границе раздела между PDMS и стеклянным покровным стеклом и выберите точки для съемки по всему периметру этого интерфейса. При среднем количестве 40 точек на изображение в камере Durex и съемке клеток каждые 10 минут на протяжении до 16 часов область интереса будет выглядеть как две линии, где внешняя линия соответствует краю покровного стекла, а внутренняя — фактической границе раздела между PDMS и покровным стеклом. Для анализа данных создайте таблицу, аналогичную той, что представлена в текстовом протоколе.
Подсчитайте количество событий пересечения из PDMS на стеклянную поверхность и наоборот для каждого созданного видеоролика. Событием пересечения считается перемещение ядра клетки через границу между PDMS и стеклом в любом направлении. Запишите количество событий пересечения в соответствующий столбец таблицы Excel для количественной оценки многократных пересечений.
Подсчитайте количество пересечений клеткой интерфейса. Полученное число следует записать в столбец Excel, соответствующий субстрату, на котором клетка находилась в конце видеозаписи. Повторите анализ для каждой клетки, пересекающей интерфейс в данном видео.
Исключите клетки, которые вышли за пределы поля зрения во время визуализации. Рассчитайте процент клеток, которые мигрировали из PDMS на стеклянную поверхность и, следовательно, подверглись дуротаксису. Для этого.
Сложите количество событий перехода из мягкого состояния в жесткое и количество множественных переходов, завершившихся в жестком состоянии, затем разделите полученную сумму на общее число событий перехода. Рассчитайте процент множественных переходов, разделив общее количество множественных переходов на общее число всех переходов, чтобы начать изучение молекулярного механизма, с помощью которого клетки реагируют на механические стимулы в окружающей среде. Специфические белки могут быть нокаутированы с использованием IRNA, как показано здесь.
Приблизительно у 70% контрольных клеток, обработанных irna, наблюдался аксониум. В резкий контраст с этим, при нокдауне CD gap с помощью РНК-интерференции (RNAi), клетки не проявляли предпочтения в отношении того, мигрируют ли они на жесткий или мягкий субстрат. Более того, клетки с нокдауном CD gap многократно пересекали границу.
В то время как клетки, обработанные контрольной siRNA, обычно пересекают границу лишь один раз, репрезентативные треки контрольных клеток с siRNA показывают, что клетки обычно мигрируют через границу один раз и преимущественно остаются на более жесткой поверхности по сравнению с CD gap. Клетки, обработанные siRNA, которые не проявили предпочтения к определенной жесткости, пересекали границу несколько раз.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготовить подложки из PDMS, собрать камеры duris и количественно определить налоги DUR.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается упрощенная система in vitro для изучения дуротаксиса клеток, при котором клетки млекопитающих преимущественно мигрируют в сторону более жестких субстратов. Использование субстратов из полидиметилсилоксана (PDMS) с заданной жесткостью позволяет исследователям управлять поведением клеток при миграции и наблюдать за ним.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейронаука
- Материаловедение
Теоретические основы
- Дуротаксис — это явление, при котором клетки перемещаются в сторону более жестких субстратов.
- Понимание механизмов миграции клеток имеет решающее значение для изучения тканевой инженерии и метастазирования рака.
- PDMS — это универсальный материал, используемый для создания субстратов с различной степенью жесткости.
- Данная работа направлена на предоставление воспроизводимого метода анализа поведения клеток в ответ на жесткость субстрата.
Цель исследования
- Разработать простой метод изучения дуротаксиса клеток.
- Исследовать влияние жесткости субстрата на миграцию клеток.
- Обеспечить возможность визуализации живых мигрирующих клеток.
Используемые методы
- Подготовка подложек из PDMS с заданной жесткостью.
- Заливка PDMS в шестилуночные планшеты и удаление пузырьков воздуха.
- Помещение стерилизованных покровных стекол на поверхность PDMS.
- Посев клеток в камеры Durotax для последующего наблюдения.
Основные результаты
- Клетки преимущественно мигрировали в сторону более жестких подложек из PDMS.
- Микроскопия живых клеток позволила получить данные о динамике миграции.
- Система обеспечила возможность контролируемого изменения жесткости подложки.
- Полученные результаты способствуют пониманию поведения клеток в различных биологических контекстах.
Выводы
- Данный протокол предлагает надежный метод изучения дуротаксиса клеток.
- Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях миграции клеток и тканевой инженерии.
- Использование подложек из PDMS эффективно для управления поведением клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот упрощенный анализ дуротаксиса позволяет биофармацевтическим группам исследований и разработок оценивать механосенсорику клеток и направленную миграцию в ответ на жесткость субстрата, что является ключевым фактором инвазии опухоли и стромальных взаимодействий. Обеспечивая воспроизводимую модель in vitro с определенным интерфейсом жесткости между PDMS и стеклом, система способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов работы белков, участвующих в путях механотрансдукции. Адаптивность данного анализа к различным типам клеток и стратегиям нокдауна расширяет его применимость на ранних этапах поиска для идентификации модуляторов дуротаксиса в качестве потенциальных терапевтических мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы о роли механочувствительных белков, таких как cdGAP, в регуляции дуротаксиса.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем установления связи между нокдауном белка и потерей предпочтения направленной миграции.
- Прогностическая ценность: Позволяет получать количественные данные о событиях пересечения для оценки влияния мишени на поведение мигрирующих клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет создавать стандартизированные интерфейсы ПДМС-стекло, подходящие для визуализации живых клеток с высоким разрешением и отслеживания их миграции.
- Воспроизводимость: исключает необходимость в химическом сшивании или использовании градиентных гелей, что повышает согласованность анализов в разных экспериментах.
- Масштабируемость: совместимость с форматом шестилуночного планшета позволяет проводить параллельное тестирование нескольких условий или генетических возмущений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует дуротаксис — процесс, участвующий в инвазии раковых клеток и развитии злокачественных новообразований под влиянием стромы.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты исследований механосенсорики на этапе поиска с доклиническими моделями метастазирования и ремоделирования тканей.
- Принятие решений с учетом рисков: Предоставляет механизмы для приоритизации мишеней на основе их роли в путях восприятия жесткости.
Интеграция в конвейер и рабочие процессы
Данный анализ вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации соединений-лидеров, особенно для путей, связывающих механику внеклеточного матрикса с фенотипами миграции клеток.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о роли механосенсоров и регуляторов ГТФаз в дуротаксисе с использованием методов визуализации живых клеток.
- Скрининг: позволяет создавать готовые к анализу системы для оценки влияния химических соединений или генетических модификаций на направленную миграцию клеток в сторону более жестких субстратов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, такие как число пересечений и процент направленной миграции, для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает данные о механосенсорике in vitro с патофизиологическими контекстами, такими как инвазия опухолей, где дуротаксис играет значимую роль.
- Корпоративное использование: создает универсальную платформу для оценки механочувствительных мишеней в рамках программ по изучению онкологии, фиброза и заживления ран.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов относительно роли мишеней в сетях механотрансдукции за счет снижения неоднозначности фенотипов миграции.
- Практическая ценность: Повышает уровень стандартизации и воспроизводимости благодаря простой системе субстратов без градиента.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go»), уточняя механистические связи между мишенями и патологическими процессами, обусловленными дуротаксисом.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе функциональной валидации в анализе механосенсорных свойств, имеющем значение для конкретного заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, прижизненной визуализацией клеток, а также методами РНК-интерференции или генетического воздействия.
- Требуется доступ к инвертированным микроскопам с системой контроля условий среды для длительной фазово-контрастной визуализации.
- Необходима стандартизация протоколов подготовки и покрытия PDMS для обеспечения стабильной жесткости субстрата.
- При расширении применения анализа на первичные клетки или 3D-модели миграции следует учитывать необходимость адаптации метода.
- Метод ограничен 2D-поверхностным дуротаксисом; он не позволяет зафиксировать сложные механизмы ремоделирования 3D-матрикса или протеолитическую инвазию.
