Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции

Общая цель этой процедуры заключается в изучении активности различных компонентов сети внутриклеточной передачи сигнала после кратковременного механического возмущения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области миграции клеток, такие как то, как клетки воспринимают и направляют миграцию к различным сигналам окружающей среды, включая механические стимулы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследовать первоначальную реакцию на механический стимул без искажающего вклада моторики или полярности в реакцию.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы проверили реакцию адгезивных клеток на хемоаттрактант, который доставлялся с небольшим перемешиванием, и мы заметили устойчивую реакцию клеток, стимулированных с помощью контроля носителя. Для начала подготовьте Klebsiella aerogenes, инокулировав небольшое количество клеток из замороженного сырья в среду HL5 без антибиотиков, и инкубируйте культуру в течение ночи. Рост Dictyostelium в присутствии бактерий Klebsiella aerogenes приведет к уменьшению количества макропиносом, что улучшит реакцию клеток на внешние раздражители.

Распланируйте время эксперимента так, чтобы когда бактерии будут готовы, диктиостелии росли в геометрической прогрессии. Соберите эти клетки Dictyostelium и подсчитайте их с помощью гемоцитометра. Затем распределите 260 микролитров бактериальной суспензии, содержащей 100 000 клеток Dictyostelium, на SM-планшет.

Также для страховки подготовьте пластины с вдвое большим и вдвое меньшим количеством клеток Dictyostelium. После одного дня роста при комнатной температуре переверните пластину и продолжайте культивировать пластину до тех пор, пока клетки Dictyostelium не начнут очищать бактериальный газон, но еще не начали агрегацию. Затем добавьте в тарелку пять миллилитров буфера DB и соскребите Dictyostelium с помощью стеклянного разбрасывателя.

Переложите ячейки и раствор в полипропиленовую трубку объемом 50 миллилитров, затем промойте пластину еще пятью миллилитрами DB и также добавьте это в 50-миллилитровую трубку. При необходимости повторите. Чтобы промыть Dictyostelium, долейте в тюбик до 50 миллилитров DB, гранулируйте клетки, а затем аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Промывайте клетки несколько раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Наконец, ресуспендируйте Dictyostelium в буфере DB примерно до пяти миллионов клеток на миллилитр. Для начала выложите два миллиона агрегационно-компетентных диктиостелий на 35-миллиметровые тарелки с двумя миллилитрами DB. Подготовьте по одной пластине для каждого временного момента и нестимулированного контроля.

При комнатной температуре дайте ячейкам 10 минут прикрепиться к пластине. Затем смойте неприкрепленные ячейки с пластины с помощью двух полосканий с одним миллилитром DB. После того, как планшеты будут очищены от неприкрепленного диктиостелия, инкубируйте прикрепленные клетки в буфере для базальтации в течение 30 минут, не беспокоя планшеты. Очень важно избегать любых движений планшетов во время получасовой инкубации, чтобы предотвратить преждевременную стимуляцию клеток.

Теперь, чтобы применить контролируемое количество механической стимуляции, по отдельности перенесите пластину в орбитальный шейкер и запустите шейкер со скоростью 150 оборотов в минуту в течение пяти секунд. Затем, по прошествии нужного времени, отсасывайте буфер и своевременно ставьте тарелку на лед. Немедленно добавьте 100 микролитров буфера для образца с ингибиторами протеазы и фосфатазы и соскребите клетки.

Соберите лизат в пробирки объемом 1,5 миллилитра и сразу же нагрейте их при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Приступайте к анализу лизатов или перенесите их на хранение при температуре минус 20 градусов Цельсия. После изготовления суспензий вегетативных или агрегационно-компетентных клеток загрузите около 600 микролитров в предметное стекло микрофлюидной камеры.

Входные отверстия должны быть полностью заполнены, поэтому при необходимости добавьте в них буфер. Дайте ячейкам прикрепиться в течение 10 минут. Подключите входную линию для устройства к электронному насосу с резервуаром на 15 миллилитров.

С помощью программного управления насосом закройте клапан и затем заполните резервуар DB. Теперь установите давление на 50 миллибар и включите насос. Заполните и промойте линию с DB, нажав на клапан, чтобы открыть его. После полоскания в течение примерно 30 секунд снова увеличьте давление до нуля, а затем закройте клапан.

Далее подсоедините леску к одному из трех входных отверстий с одной стороны горки. Не задерживайте пузырьки воздуха, и как только соединение будет выполнено, закройте два других входа с этой стороны затвора. Теперь завершите настройку, подключив линию от слива к единственному выпускному отверстию на противоположной стороне горки.

Затем под светлым или фазовым освещением на флуоресцентном микроскопе просмотрите канал с помощью 20-кратного воздушного объектива и промойте канал. Далее установите давление примерно на 50 миллибар и откройте клапан. Как только жидкость выйдет из слива, уменьшите внешнее давление до нуля, подождите около 30 секунд и закройте клапан.

Затем переключитесь на масляный объектив 40X, сфокусируйтесь на самой широкой части канала и подготовьте программное обеспечение к сбору изображений каждые три секунды с подсветкой RFP или GFP. При закрытом клапане установите давление на нужное значение. Затем получите пять изображений предварительной стимуляции с трехсекундными интервалами.

Далее кратковременно откройте клапан для подачи стимула. Теперь соберите еще как минимум 15 кадров данных в течение 45 секунд. Количественно оцените ответ, как описано в текстовом протоколе.

Сначала загрузите микрофлюидное предметное стекло с помощью диктиостелия, как описано в предыдущем разделе. Для этого эксперимента подготовьте две входные линии. Чтобы замкнуть линии, используйте физический зажим на линии, по которой транспортируется раствор для очистки, и клапан с программным управлением, чтобы закрыть линию, перевозящую раствор DB с транспортным средством.

Теперь заполните две линии подходящим раствором: буфер плюс только транспортное средство или буфер с обработкой, такой как ингибитор. После того, как стропы будут промыты, соедините их с двумя входными отверстиями со стороны затвора с каналом и закройте неиспользуемое входное отверстие. Затем подсоедините дренажную магистраль к выпускному отверстию с противоположной стороны.

Теперь промойте предметное стекло с помощью буфера и транспортного средства, как описано ранее. Затем заполните канал с обработкой. Во-первых, уменьшите расход до нуля миллибар.

Затем поменяйте местами клапаны, подавайте обработку в течение примерно 15 секунд и начните измерять время инкубации. Каждые 10 минут или около того подавайте свежий раствор для лечения на клетки в течение примерно 15 секунд, чтобы восполнить уровень кислорода в камере. Адгезивные агрегационно-компетентные клетки подвергались воздействию пятисекундного потока сдвига с использованием орбитального встряхивателя.

Dictyostelium были предварительно обработаны кофеином для снижения их базальной активности. В результате наблюдалась очень низкая базальная активность PKBR1 и ERK2 и значительное увеличение фосфорилирования ключевых остатков этих киназ при стимуляции. В агрегационно-компетентных клетках, экспрессирующих различные флуоресцентно меченные биосенсоры, два маркера переднего края, PHcrac и LimE, которые рекрутируются PIP3 или недавно полимеризованным актином, показали в основном цитозольную локализацию в покоящихся клетках.

После пяти секунд сдвигового потока эти биосенсоры быстро перелокализовались в коре головного мозга и вернулись в цитозоль. Эффекты деполимеризующего актина препарата Латрункулин А были проверены с помощью аналогичного эксперимента с силой сдвига. В этом случае вегетативные клетки сначала подвергались воздействию контрольных условий, а затем переключались на буфер, который содержал желаемый тестируемый агент.

Лечение латрункулином А блокировало повторную локализацию маркеров переднего края в коре головного мозга. Интересно, что если поток не прекращался через две секунды, а оставался включенным в течение всего эксперимента, все равно наблюдалась временная глобальная реакция. Следуя глобальной реакции, вегетативные клетки мигрировали против течения.

Правильная подготовка клеток чрезвычайно важна для успеха этих анализов. Вегетативные клетки должны выращиваться в сочетании с бактериями, чтобы обеспечить их реакцию на механическую стимуляцию. Что касается агрегационно-компетентных клеток, то клетки, которые либо недоразвиты, либо переразвиты, как правило, плохо реагируют.

Биохимический и микроскопический подходы дополняют друг друга, что позволило нам оценить большое количество промежуточных продуктов передачи сигнала на предмет их реакции на механическую стимуляцию. Добавив фармакологические, а также генетические возмущения, мы можем узнать, как воспринимаются и передаются механические стимулы. Это важно для понимания направленной миграции клеток, которая управляется физическими стимулами, такими как сдвиговый поток.

Поскольку механическая стимуляция запускает активацию той же сети передачи сигнала, что и хемоаттрактанты, теперь мы можем изучить интеграцию различных стимулов в клетки. В конечном счете, эти исследования помогут нам понять, как мигрирующие клетки, такие как наши собственные иммунные клетки и метастатические раковые клетки, перемещаются по организму.